引用本文： 徐灵彬, 韩新鹏, 吴昌归. 二甲双胍抑制哮喘模型大鼠气道重塑的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(2): 95-100. doi: 10.7507/1671-6205.202008031 复制
支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病[1]，虽然有多种抗炎药物以及支气管舒张剂用于治疗，但部分患者病情持续进展并出现气道重塑，从而导致不完全可逆的阻塞性通气功能障碍，因此寻找可预防或治疗气道重塑的药物对这些患者的预后及生活质量的提升非常关键。二甲双胍是广泛使用的治疗 2 型糖尿病的药物，其在体外可抑制多种细胞的增殖，机制与一磷酸腺苷活化的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信号通路有关[2]。目前尚无关于二甲双胍用于预防哮喘患者气道重塑的研究，为了解二甲双胍对哮喘患者气道重塑的影响及作用机制，我们对哮喘大鼠模型给予二甲双胍和雷帕霉素干预，观察其对气道重塑的影响，以期为哮喘气道重塑寻求新的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
无特定病原（SPF）级别的 6～8 周龄雄性 B/N 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司并饲养在空军军医大学药物基因研究所动物中心（达 SPF 级别）。所有实验遵从空军军医大学动物伦理委员会制定的“实验室动物管理原则”。实验动物在安静、无抗原、通风良好的环境中饲养，实验室按昼夜节律采光 12 h，室温保持 20～25 ℃，湿度保持在 40%～70%，动物可自由摄食、饮水。在适应性喂养 1 周后，28 只 B/N 大鼠随机分为四组（每组 7 只）：对照组、哮喘组、二甲双胍干预组（简称二甲双胍组）和雷帕霉素干预组（简称雷帕霉素组）。
1.2 方法
1.2.1 致敏、激发及药物干预
依照参考文献[3]的方法利用卵清蛋白（OVA，V 级，Sigma-Aldrich 公司）制备哮喘模型方法。在适应性喂养大鼠 1 周后，哮喘组、二甲双胍组和雷帕霉素组大鼠腹腔内注射 1 mL OVA 和 ImjectTM Alum Adjuvant（Thermo Scientific）的混合液进行致敏，混合液中 OVA 浓度为 100 mg/mL，氢氧化铝浓度为 20 mg/mL，氢氧化镁浓度为 20 mg/mL，对照组大鼠腹腔内注射等容积的 0.9% 的氯化钠注射液。致敏共 3 次，每次间隔 7 d。从第 21 天开始对哮喘组、二甲双胍组和雷帕霉素组大鼠使用压缩空气式雾化器雾化 10% 的 OVA 氯化钠溶液 30 min 进行激发，激发每周 3 次，共 25 次；对照组使用压缩空气式雾化器雾化 0.9% 的氯化钠注射液 30 min。二甲双胍组在雾化激发干预前 30 min 根据体重予腹腔内注射 100 mg/kg 的二甲双胍（溶媒 0.9% 氯化钠注射液）和等体积二甲基亚砜（DMSO）溶液；雷帕霉素组在雾化激发干预前 30 min 根据体重分别予腹腔内注射 2 mg/kg 的雷帕霉素（溶媒为 DMSO）和等体积的 0.9% 氯化钠注射液；哮喘组和对照组在雾化激发干预前予等体积的 0.9% 氯化钠注射液和 DMSO 溶液。
1.2.2 大鼠气道阻力及气道反应性测定
在最后一次激发完成 48 h 后，使用 30 mg/kg 巴比妥腹腔注射麻醉后将大鼠固定在恒温板上，并监测其直肠温度。解剖大鼠气管后在第二气管环行气管切开，置入直径 2 mm 的聚乙烯导管并连接呼吸机，设置潮气量 8 mL/kg，呼吸频率 80 次/min，吸气时间 0.25 s。腹腔内注射 10 mg/kg 的泮库溴铵对大鼠进行肌松，使用吸气阻断法[4]测定大鼠的初始气道阻力后，按梯度递增吸入氯乙酰胆碱（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L 的乙酰胆碱）溶液后分别测试气道阻力。每次测试前大鼠进行机械通气 3～5 min，断开呼吸机气管插管连接恒速泵（设置潮气量 3 mL，气体流速 4 mL/s）同时监测并记录气管插管处的压力，每次测试时间不超过 20 s。根据监测到的气道峰压与平台压等数据计算气道阻力。
1.2.3 肺组织病理学检查
测定完大鼠气道阻力和气道反应性后使用放血法处死大鼠，取大鼠的左肺组织进行固定、包埋、切片，分别使用苏木精–伊红染色观察气道炎症细胞浸润、过碘酸希夫（PAS）染色观察气道壁杯状细胞增生、马松三色染色观察气道壁纤维化和重塑情况。采用半定量评分（0～4）评价支气管周围炎症细胞浸润情况，0 分为正常；1 分是少量细胞浸润；2 分为一层细胞环状浸润；3 分为 2～4 层细胞形成环状浸润；4 分是多于 4 层的细胞浸润环。使用每高倍视野 PAS 阳性杯状细胞面积定量气道壁杯状细胞增生情况；使用胶原纤维面积占高倍镜视野面积的百分比表示肺组织中胶原纤维的沉积程度。
1.2.4 气道平滑肌定量测量
对切片使用免疫组织化学 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色法测定气道平滑肌增殖情况[5]。使用 Iamge-pro plus 6.0 软件测量每一细支气管壁 α-SMA 染色的面积，并测量每一细支气管基底膜的长度。以单位长度的支气管基底膜所含的 α-SMA 染色面积表示气道壁的平滑肌增殖程度，每一张切片最少计数 10 个细支气管。
1.2.5 蛋白印迹法检测 AMPK/mTOR 通路蛋白、S 相激酶关联蛋白 2 和 p21 表达
提取组织蛋白并定量后使用蛋白印迹法分别检测组织中总 mTOR（t-mTOR）、磷酸化 mTOR（p-mTOR）、总核糖体蛋白质 S6 激酶 1（t-p70s6k1）、磷酸化核糖体蛋白质 S6 激酶 1（p-p70s6k1）、S 相激酶关联蛋白 2（SKP2）及 p21 的表达，其中 p-mTOR 和 p-p70s6k1 的表达分别以 t-mTOR 和 t-p70s6k1 为参照，而 SKP2 和 p21 的表达以 β-actin 为参照。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 18.0 统计软件。数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，多组间比较分析采用单因素方差分析，均数间多重比较采用 Turkey 法。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 气道反应性测定
如图 1 所示，吸入氯乙酰胆碱后气道阻力逐渐升高。二甲双胍或雷帕霉素干预可使气道阻力降低（P<0.05），两者具有相似的干预效果（P>0.05）。
图1
各组大鼠的气道阻力
与对照组比较，哮喘组大鼠在乙酰胆碱浓度为 0.01、0.1 和 1 mmol/L 时气道阻力明显增加（
2.2 肺组织病理学改变
对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组的肺组织炎症程度评分分别为（0.4±0.1）、（3.5±0.2）、（2.1±0.2）和（1.9±0.1）分。与对照组比较，哮喘组上皮下、支气管周围以及血管周围均出现了明显的炎细胞浸润，同时出现了气道管径狭窄、上皮下纤维化等改变，两组的肺组织炎症程度评分比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，二甲双胍组和雷帕霉素组肺组织中炎细胞浸润以及气道壁结构的变化明显减轻（P<0.05），二甲双胍组和雷帕霉素组间肺组织炎症程度评分差异无统计学意义（P>0.05），两者具有相似作用。结果见图 2。
图2
各组大鼠肺组织病理检查像（苏木精–伊红×100）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管壁上皮下、细支气管周围以及小血管周围的炎症反应，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减轻上述炎症反应
2.3 气道上皮中杯状细胞增生
在 PAS 染色后，对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组的每高倍镜下 PAS 阳性细胞面积分别为（0.65±0.11）、（30.36±6.46）、（9.88±2.60）和（11.85±3.43）μm2。哮喘组的细支气管上皮细胞中 PAS 阳性的杯状细胞较对照组明显增加（P<0.01），而二甲双胍组和雷帕霉素组 PAS 阳性细胞面积与哮喘组相比明显减少（P<0.05）。结果见图 3。
图3
各组大鼠肺组织病理检查像（PAS ×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管上皮杯状细胞明显增生，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减少杯状细胞增生
2.4 肺组织中胶原纤维的沉积
马松三色染色后，对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组肺组织中胶原纤维的比例分别为（5.41±2.95）%、（22.94±4.12）%、（13.11±1.05）% 和（8.40±1.30）%。与对照组相比，哮喘组肺组织中胶原纤维沉积明显增加（P<0.01），而在激发前腹腔内注射二甲双胍或雷帕霉素，可明显减轻肺组织中胶原纤维沉积（P<0.05）。结果见图 4。
图4
各组大鼠肺组织病理检查像（马松三色×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠肺组织中胶原纤维沉积，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减少肺组织中胶原纤维沉积
2.5 支气管平滑肌增生
对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组肺组织中细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域分别为（4.60±0.21）、（7.20±0.28）、（5.82±0.28）和（6.05±0.38）μm2/μm。与对照组相比，哮喘组中细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域明显增加（P<0.01），二甲双胍组细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域较哮喘组减少（P<0.05），使用雷帕霉素干预亦具有相似效应，二甲双胍组与雷帕霉素组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 5。
图5
各组大鼠肺组织病理检查像（α-SMA ×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管壁气道平滑肌明显增生，而二甲双胍和雷帕霉素的治疗能明显减少气道平滑肌增生
2.6 肺组织中 AMPK/mTOR 通路相关蛋白表达情况
与对照组相比，哮喘组肺组织中 p-mTOR、p-p70s6k1 蛋白表达明显增加，其中 p-mTOR 表达增加了（1.40±0.04）倍（P<0.01），而 p-p70s6k1 表达增加了（1.55±0.10）倍（P<0.01）。与哮喘组比较，二甲双胍组 p-mTOR 和 p-p70s6k1 表达显著降低（图 6），与对照组相似。与对照组相比，哮喘组 SKP2 表达明显增加，而 p21 蛋白表达明显减少。二甲双胍干预后，SKP2 表达较哮喘组明显减少，而 p21 蛋白表达明显增加（均 P <0.05）。雷帕霉素干预后对上述分子的表达具有类似影响，二甲双胍组与雷帕霉素组比较，差异均无统计学意义（均 P>0.05）。
图6
p-mTOR、p-p70s6k1、SKP2 和 p21 蛋白在各组大鼠肺组织中的表达情况
3 讨论
有关哮喘发病机制的研究、新治疗方法的评价都依赖于动物实验，但动物自发形成的哮喘很少见，哮喘动物模型都需外源性抗原反复刺激才能建立[3]。B/N 大鼠是常用的模拟人类支气管哮喘的一种动物，其致敏常用的方法有 OVA 致敏、尘螨致敏等，其中 OVA 致敏方案是使用最广泛的构建哮喘模型动物的方法[3, 6-7]，在本研究中哮喘组大鼠的气道反应性测定和肺组织病理学检查均证实了哮喘模型动物的建立是成功的。
气道慢性炎症是哮喘的主要病理改变，气道高反应性是哮喘的主要病理生理特征。气道炎症反复发作或持续存在，可能导致气道重塑，而气道重塑使哮喘患者对现有抗炎药和支气管舒张剂反应不佳，肺功能表现为不完全可逆的气道阻塞[8]。气道重塑涉及整个气道壁的结构，包括细胞外基质蛋白沉积增加、上皮下纤维化、杯状细胞化生、黏液腺肥大、平滑肌增生和肥大以及上皮受损，其中支气管平滑肌细胞的肥大、增殖是哮喘患者气道重塑的重要特征[8-9]。文献报道二甲双胍可以通过降低趋化因子和炎症因子的表达，从而减少炎性细胞浸润，发挥抗炎的作用。Calixto 等[10]发现二甲双胍能抑制高脂诱导的肥胖型哮喘小鼠 BALF 中炎性细胞的渗出；Park 等[11]在 OVA 和真菌相关变应原蛋白诱导哮喘小鼠中也观察到此现象，并且对 AMPK 缺陷的模型哮喘小鼠与野生型哮喘小鼠进行比较，同时给予二甲双胍干预后发现，AMPK 缺陷小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润及气道重塑加重，提示二甲双胍的作用依赖于 AMPK 的活化。本研究亦证实：哮喘组大鼠气道周围和血管周围的炎性细胞浸润较对照组明显增加，二甲双胍能明显缓解哮喘模型动物气道周围和血管周围的炎性细胞浸润。而气道反应性的测定提示哮喘组大鼠吸入高浓度的氯乙酰胆碱后气道阻力较对照组明显增加，使用二甲双胍干预后，大鼠在吸入高浓度氯乙酰胆碱后，气道阻力较哮喘组明显降低，提示二甲双胍可有效地降低模型大鼠的气道高反应性。因此有理由推测二甲双胍是通过激活 AMPK 导致的抗炎作用减轻了哮喘模型动物的气道周围炎症，从而改善了其气道反应性。
气道平滑肌的增生和肥大是哮喘气道重塑的一个重要特征改变。在体外细胞培养中发现二甲双胍可抑制包括多种肿瘤细胞系在内的细胞增殖，动物实验也证实二甲双胍存在明显的抗炎、抑制血管壁重塑等多重作用且与激活 AMPK 通路有关[12-13]。AMPK 抑制细胞的增殖可能与其负性调控 mTOR 通路有关，当细胞内 AMP/ATP 比例增高时，AMPK 被激活，AMPK 活化使结节硬化性复合体 2 磷酸化，从而负性调控 mTOR1，使蛋白合成受阻，从而抑制细胞生长、增殖[14]。本研究证实：二甲双胍与雷帕霉素能抑制支气管气道上皮细胞中杯状细胞增生、黏液腺的分泌、内皮下及细支气管周围胶原蛋白沉积、纤维化等变化，同时也减轻细支气管中膜平滑肌细胞增生和肥大。为进一步研究二甲双胍抑制哮喘模型动物气道重塑的作用机制，我们使用蛋白印迹法测定了肺组织中 mTOR 及其磷酸化水平以及 mTOR 下游的 p70s6k1 及其磷酸化水平。结果表明：肺组织中 t-mTOR 和 t-p70s6k1 无明显变化，而哮喘组 p-mTOR 及其下游的 p-p70s6k1 表达较对照组明显增加，表明哮喘模型动物肺组织中 mTOR 通路被激活，可能是导致气道重塑的重要环节。在本研究中，雷帕霉素通过抑制 mTOR 的磷酸化，明显减轻了哮喘模型大鼠气道上皮中杯状细胞的增生、气道壁及肺组织中胶原纤维的沉积以及细支气管平滑肌的增生、肥大。而二甲双胍干预组亦得到了雷帕霉素干预相似的结果，推测二甲双胍干预可能通过激活 AMPK，进而负性调控 mTOR 通路，达到减轻气道重塑的效果。
p21 蛋白是有效的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。p21 结合并抑制 cyclin-CDK2、cyclin-CDK1 和 cyclin-CDK4/6 复合物的活性，从而起到 G1 和 S 期细胞周期进程调节的作用。而 p21 蛋白水平的调节是通过泛素化和蛋白酶体降解而下调[15]。SKP2 是一种能与 S 期激酶 cyclinA-CDK1 相互作用的蛋白，作为 F-box 蛋白家族中的一员，SKP2 是构成泛素连接酶复合物的主要成分之一，能特异性识别磷酸化底物并介导其泛素化降解，从而参与细胞周期的调控。泛素连接酶可使泛素连接至 p21 及 p27 等蛋白分子上，介导 p21 及 p27 蛋白的降解[16]。研究报道，激活 mTOR 信号通路可以上调 SKP2 表达，从而降低 p21 和 p27 的浓度，并使细胞从 G1 期进入 S 期，促进细胞增殖[17]。在本实验中，哮喘模型大鼠的肺组织中 SKP2 表达增加，而 p21 蛋白表达减少，而通过抑制 mTOR 活性（雷帕霉素直接抑制或通过激活 AMPK 后抑制 mTOR 活性），SKP2 表达下调伴随有 p21 蛋白表达的上调。以上结果提示在哮喘模型动物中，SKP2 表达增强，使 p21 降解增加，细胞从 G1 期向 S 期的转换，促进细胞增殖，从而造成气道的重塑。
综上所述，二甲双胍可以通过激活 AMPK、进而抑制 mTOR 通路来缓解哮喘模型动物的气道高反应性，并抑制其气道的重塑，二甲双胍有可能成为治疗哮喘和预防气道重塑新的选择，但二甲双胍是否能够有效缓解哮喘患者的气道反应性并抑制气道重塑尚需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病[1]，虽然有多种抗炎药物以及支气管舒张剂用于治疗，但部分患者病情持续进展并出现气道重塑，从而导致不完全可逆的阻塞性通气功能障碍，因此寻找可预防或治疗气道重塑的药物对这些患者的预后及生活质量的提升非常关键。二甲双胍是广泛使用的治疗 2 型糖尿病的药物，其在体外可抑制多种细胞的增殖，机制与一磷酸腺苷活化的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信号通路有关[2]。目前尚无关于二甲双胍用于预防哮喘患者气道重塑的研究，为了解二甲双胍对哮喘患者气道重塑的影响及作用机制，我们对哮喘大鼠模型给予二甲双胍和雷帕霉素干预，观察其对气道重塑的影响，以期为哮喘气道重塑寻求新的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
无特定病原（SPF）级别的 6～8 周龄雄性 B/N 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司并饲养在空军军医大学药物基因研究所动物中心（达 SPF 级别）。所有实验遵从空军军医大学动物伦理委员会制定的“实验室动物管理原则”。实验动物在安静、无抗原、通风良好的环境中饲养，实验室按昼夜节律采光 12 h，室温保持 20～25 ℃，湿度保持在 40%～70%，动物可自由摄食、饮水。在适应性喂养 1 周后，28 只 B/N 大鼠随机分为四组（每组 7 只）：对照组、哮喘组、二甲双胍干预组（简称二甲双胍组）和雷帕霉素干预组（简称雷帕霉素组）。
1.2 方法
1.2.1 致敏、激发及药物干预
依照参考文献[3]的方法利用卵清蛋白（OVA，V 级，Sigma-Aldrich 公司）制备哮喘模型方法。在适应性喂养大鼠 1 周后，哮喘组、二甲双胍组和雷帕霉素组大鼠腹腔内注射 1 mL OVA 和 ImjectTM Alum Adjuvant（Thermo Scientific）的混合液进行致敏，混合液中 OVA 浓度为 100 mg/mL，氢氧化铝浓度为 20 mg/mL，氢氧化镁浓度为 20 mg/mL，对照组大鼠腹腔内注射等容积的 0.9% 的氯化钠注射液。致敏共 3 次，每次间隔 7 d。从第 21 天开始对哮喘组、二甲双胍组和雷帕霉素组大鼠使用压缩空气式雾化器雾化 10% 的 OVA 氯化钠溶液 30 min 进行激发，激发每周 3 次，共 25 次；对照组使用压缩空气式雾化器雾化 0.9% 的氯化钠注射液 30 min。二甲双胍组在雾化激发干预前 30 min 根据体重予腹腔内注射 100 mg/kg 的二甲双胍（溶媒 0.9% 氯化钠注射液）和等体积二甲基亚砜（DMSO）溶液；雷帕霉素组在雾化激发干预前 30 min 根据体重分别予腹腔内注射 2 mg/kg 的雷帕霉素（溶媒为 DMSO）和等体积的 0.9% 氯化钠注射液；哮喘组和对照组在雾化激发干预前予等体积的 0.9% 氯化钠注射液和 DMSO 溶液。
1.2.2 大鼠气道阻力及气道反应性测定
在最后一次激发完成 48 h 后，使用 30 mg/kg 巴比妥腹腔注射麻醉后将大鼠固定在恒温板上，并监测其直肠温度。解剖大鼠气管后在第二气管环行气管切开，置入直径 2 mm 的聚乙烯导管并连接呼吸机，设置潮气量 8 mL/kg，呼吸频率 80 次/min，吸气时间 0.25 s。腹腔内注射 10 mg/kg 的泮库溴铵对大鼠进行肌松，使用吸气阻断法[4]测定大鼠的初始气道阻力后，按梯度递增吸入氯乙酰胆碱（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L 的乙酰胆碱）溶液后分别测试气道阻力。每次测试前大鼠进行机械通气 3～5 min，断开呼吸机气管插管连接恒速泵（设置潮气量 3 mL，气体流速 4 mL/s）同时监测并记录气管插管处的压力，每次测试时间不超过 20 s。根据监测到的气道峰压与平台压等数据计算气道阻力。
1.2.3 肺组织病理学检查
测定完大鼠气道阻力和气道反应性后使用放血法处死大鼠，取大鼠的左肺组织进行固定、包埋、切片，分别使用苏木精–伊红染色观察气道炎症细胞浸润、过碘酸希夫（PAS）染色观察气道壁杯状细胞增生、马松三色染色观察气道壁纤维化和重塑情况。采用半定量评分（0～4）评价支气管周围炎症细胞浸润情况，0 分为正常；1 分是少量细胞浸润；2 分为一层细胞环状浸润；3 分为 2～4 层细胞形成环状浸润；4 分是多于 4 层的细胞浸润环。使用每高倍视野 PAS 阳性杯状细胞面积定量气道壁杯状细胞增生情况；使用胶原纤维面积占高倍镜视野面积的百分比表示肺组织中胶原纤维的沉积程度。
1.2.4 气道平滑肌定量测量
对切片使用免疫组织化学 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色法测定气道平滑肌增殖情况[5]。使用 Iamge-pro plus 6.0 软件测量每一细支气管壁 α-SMA 染色的面积，并测量每一细支气管基底膜的长度。以单位长度的支气管基底膜所含的 α-SMA 染色面积表示气道壁的平滑肌增殖程度，每一张切片最少计数 10 个细支气管。
1.2.5 蛋白印迹法检测 AMPK/mTOR 通路蛋白、S 相激酶关联蛋白 2 和 p21 表达
提取组织蛋白并定量后使用蛋白印迹法分别检测组织中总 mTOR（t-mTOR）、磷酸化 mTOR（p-mTOR）、总核糖体蛋白质 S6 激酶 1（t-p70s6k1）、磷酸化核糖体蛋白质 S6 激酶 1（p-p70s6k1）、S 相激酶关联蛋白 2（SKP2）及 p21 的表达，其中 p-mTOR 和 p-p70s6k1 的表达分别以 t-mTOR 和 t-p70s6k1 为参照，而 SKP2 和 p21 的表达以 β-actin 为参照。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 18.0 统计软件。数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，多组间比较分析采用单因素方差分析，均数间多重比较采用 Turkey 法。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 气道反应性测定
如图 1 所示，吸入氯乙酰胆碱后气道阻力逐渐升高。二甲双胍或雷帕霉素干预可使气道阻力降低（P<0.05），两者具有相似的干预效果（P>0.05）。
图1
各组大鼠的气道阻力
与对照组比较，哮喘组大鼠在乙酰胆碱浓度为 0.01、0.1 和 1 mmol/L 时气道阻力明显增加（
2.2 肺组织病理学改变
对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组的肺组织炎症程度评分分别为（0.4±0.1）、（3.5±0.2）、（2.1±0.2）和（1.9±0.1）分。与对照组比较，哮喘组上皮下、支气管周围以及血管周围均出现了明显的炎细胞浸润，同时出现了气道管径狭窄、上皮下纤维化等改变，两组的肺组织炎症程度评分比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，二甲双胍组和雷帕霉素组肺组织中炎细胞浸润以及气道壁结构的变化明显减轻（P<0.05），二甲双胍组和雷帕霉素组间肺组织炎症程度评分差异无统计学意义（P>0.05），两者具有相似作用。结果见图 2。
图2
各组大鼠肺组织病理检查像（苏木精–伊红×100）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管壁上皮下、细支气管周围以及小血管周围的炎症反应，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减轻上述炎症反应
2.3 气道上皮中杯状细胞增生
在 PAS 染色后，对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组的每高倍镜下 PAS 阳性细胞面积分别为（0.65±0.11）、（30.36±6.46）、（9.88±2.60）和（11.85±3.43）μm2。哮喘组的细支气管上皮细胞中 PAS 阳性的杯状细胞较对照组明显增加（P<0.01），而二甲双胍组和雷帕霉素组 PAS 阳性细胞面积与哮喘组相比明显减少（P<0.05）。结果见图 3。
图3
各组大鼠肺组织病理检查像（PAS ×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管上皮杯状细胞明显增生，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减少杯状细胞增生
2.4 肺组织中胶原纤维的沉积
马松三色染色后，对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组肺组织中胶原纤维的比例分别为（5.41±2.95）%、（22.94±4.12）%、（13.11±1.05）% 和（8.40±1.30）%。与对照组相比，哮喘组肺组织中胶原纤维沉积明显增加（P<0.01），而在激发前腹腔内注射二甲双胍或雷帕霉素，可明显减轻肺组织中胶原纤维沉积（P<0.05）。结果见图 4。
图4
各组大鼠肺组织病理检查像（马松三色×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠肺组织中胶原纤维沉积，而二甲双胍和雷帕霉素的干预能明显减少肺组织中胶原纤维沉积
2.5 支气管平滑肌增生
对照组、哮喘组、雷帕霉素组和二甲双胍组肺组织中细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域分别为（4.60±0.21）、（7.20±0.28）、（5.82±0.28）和（6.05±0.38）μm2/μm。与对照组相比，哮喘组中细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域明显增加（P<0.01），二甲双胍组细支气管壁的 α-SMA 染色阳性区域较哮喘组减少（P<0.05），使用雷帕霉素干预亦具有相似效应，二甲双胍组与雷帕霉素组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 5。
图5
各组大鼠肺组织病理检查像（α-SMA ×200）
反复的 OVA 激发可导致大鼠细支气管壁气道平滑肌明显增生，而二甲双胍和雷帕霉素的治疗能明显减少气道平滑肌增生
2.6 肺组织中 AMPK/mTOR 通路相关蛋白表达情况
与对照组相比，哮喘组肺组织中 p-mTOR、p-p70s6k1 蛋白表达明显增加，其中 p-mTOR 表达增加了（1.40±0.04）倍（P<0.01），而 p-p70s6k1 表达增加了（1.55±0.10）倍（P<0.01）。与哮喘组比较，二甲双胍组 p-mTOR 和 p-p70s6k1 表达显著降低（图 6），与对照组相似。与对照组相比，哮喘组 SKP2 表达明显增加，而 p21 蛋白表达明显减少。二甲双胍干预后，SKP2 表达较哮喘组明显减少，而 p21 蛋白表达明显增加（均 P <0.05）。雷帕霉素干预后对上述分子的表达具有类似影响，二甲双胍组与雷帕霉素组比较，差异均无统计学意义（均 P>0.05）。
图6
p-mTOR、p-p70s6k1、SKP2 和 p21 蛋白在各组大鼠肺组织中的表达情况
3 讨论
有关哮喘发病机制的研究、新治疗方法的评价都依赖于动物实验，但动物自发形成的哮喘很少见，哮喘动物模型都需外源性抗原反复刺激才能建立[3]。B/N 大鼠是常用的模拟人类支气管哮喘的一种动物，其致敏常用的方法有 OVA 致敏、尘螨致敏等，其中 OVA 致敏方案是使用最广泛的构建哮喘模型动物的方法[3, 6-7]，在本研究中哮喘组大鼠的气道反应性测定和肺组织病理学检查均证实了哮喘模型动物的建立是成功的。
气道慢性炎症是哮喘的主要病理改变，气道高反应性是哮喘的主要病理生理特征。气道炎症反复发作或持续存在，可能导致气道重塑，而气道重塑使哮喘患者对现有抗炎药和支气管舒张剂反应不佳，肺功能表现为不完全可逆的气道阻塞[8]。气道重塑涉及整个气道壁的结构，包括细胞外基质蛋白沉积增加、上皮下纤维化、杯状细胞化生、黏液腺肥大、平滑肌增生和肥大以及上皮受损，其中支气管平滑肌细胞的肥大、增殖是哮喘患者气道重塑的重要特征[8-9]。文献报道二甲双胍可以通过降低趋化因子和炎症因子的表达，从而减少炎性细胞浸润，发挥抗炎的作用。Calixto 等[10]发现二甲双胍能抑制高脂诱导的肥胖型哮喘小鼠 BALF 中炎性细胞的渗出；Park 等[11]在 OVA 和真菌相关变应原蛋白诱导哮喘小鼠中也观察到此现象，并且对 AMPK 缺陷的模型哮喘小鼠与野生型哮喘小鼠进行比较，同时给予二甲双胍干预后发现，AMPK 缺陷小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润及气道重塑加重，提示二甲双胍的作用依赖于 AMPK 的活化。本研究亦证实：哮喘组大鼠气道周围和血管周围的炎性细胞浸润较对照组明显增加，二甲双胍能明显缓解哮喘模型动物气道周围和血管周围的炎性细胞浸润。而气道反应性的测定提示哮喘组大鼠吸入高浓度的氯乙酰胆碱后气道阻力较对照组明显增加，使用二甲双胍干预后，大鼠在吸入高浓度氯乙酰胆碱后，气道阻力较哮喘组明显降低，提示二甲双胍可有效地降低模型大鼠的气道高反应性。因此有理由推测二甲双胍是通过激活 AMPK 导致的抗炎作用减轻了哮喘模型动物的气道周围炎症，从而改善了其气道反应性。
气道平滑肌的增生和肥大是哮喘气道重塑的一个重要特征改变。在体外细胞培养中发现二甲双胍可抑制包括多种肿瘤细胞系在内的细胞增殖，动物实验也证实二甲双胍存在明显的抗炎、抑制血管壁重塑等多重作用且与激活 AMPK 通路有关[12-13]。AMPK 抑制细胞的增殖可能与其负性调控 mTOR 通路有关，当细胞内 AMP/ATP 比例增高时，AMPK 被激活，AMPK 活化使结节硬化性复合体 2 磷酸化，从而负性调控 mTOR1，使蛋白合成受阻，从而抑制细胞生长、增殖[14]。本研究证实：二甲双胍与雷帕霉素能抑制支气管气道上皮细胞中杯状细胞增生、黏液腺的分泌、内皮下及细支气管周围胶原蛋白沉积、纤维化等变化，同时也减轻细支气管中膜平滑肌细胞增生和肥大。为进一步研究二甲双胍抑制哮喘模型动物气道重塑的作用机制，我们使用蛋白印迹法测定了肺组织中 mTOR 及其磷酸化水平以及 mTOR 下游的 p70s6k1 及其磷酸化水平。结果表明：肺组织中 t-mTOR 和 t-p70s6k1 无明显变化，而哮喘组 p-mTOR 及其下游的 p-p70s6k1 表达较对照组明显增加，表明哮喘模型动物肺组织中 mTOR 通路被激活，可能是导致气道重塑的重要环节。在本研究中，雷帕霉素通过抑制 mTOR 的磷酸化，明显减轻了哮喘模型大鼠气道上皮中杯状细胞的增生、气道壁及肺组织中胶原纤维的沉积以及细支气管平滑肌的增生、肥大。而二甲双胍干预组亦得到了雷帕霉素干预相似的结果，推测二甲双胍干预可能通过激活 AMPK，进而负性调控 mTOR 通路，达到减轻气道重塑的效果。
p21 蛋白是有效的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。p21 结合并抑制 cyclin-CDK2、cyclin-CDK1 和 cyclin-CDK4/6 复合物的活性，从而起到 G1 和 S 期细胞周期进程调节的作用。而 p21 蛋白水平的调节是通过泛素化和蛋白酶体降解而下调[15]。SKP2 是一种能与 S 期激酶 cyclinA-CDK1 相互作用的蛋白，作为 F-box 蛋白家族中的一员，SKP2 是构成泛素连接酶复合物的主要成分之一，能特异性识别磷酸化底物并介导其泛素化降解，从而参与细胞周期的调控。泛素连接酶可使泛素连接至 p21 及 p27 等蛋白分子上，介导 p21 及 p27 蛋白的降解[16]。研究报道，激活 mTOR 信号通路可以上调 SKP2 表达，从而降低 p21 和 p27 的浓度，并使细胞从 G1 期进入 S 期，促进细胞增殖[17]。在本实验中，哮喘模型大鼠的肺组织中 SKP2 表达增加，而 p21 蛋白表达减少，而通过抑制 mTOR 活性（雷帕霉素直接抑制或通过激活 AMPK 后抑制 mTOR 活性），SKP2 表达下调伴随有 p21 蛋白表达的上调。以上结果提示在哮喘模型动物中，SKP2 表达增强，使 p21 降解增加，细胞从 G1 期向 S 期的转换，促进细胞增殖，从而造成气道的重塑。
综上所述，二甲双胍可以通过激活 AMPK、进而抑制 mTOR 通路来缓解哮喘模型动物的气道高反应性，并抑制其气道的重塑，二甲双胍有可能成为治疗哮喘和预防气道重塑新的选择，但二甲双胍是否能够有效缓解哮喘患者的气道反应性并抑制气道重塑尚需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
