引用本文： 王远芳, 邓杰伦, 敖科萍, 李冬冬, 谢轶, 应斌武. 三种 SARS-CoV-2 抗体胶体金试剂诊断效能评价及假阳性控制策略探讨. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(3): 214-218. doi: 10.7507/1671-6205.202003194 复制
冠状病毒是属于冠状病毒科的有包膜的非节段的正义 RNA 病毒，包括 CoV-229E、OC43、NL63 和 HKU1，广泛分布于人和其他哺乳动物中[1]，通常引起轻度的呼吸道疾病，但近年发生的重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrom，SARS）和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrom，MERS）也是由冠状病毒引起的，分别为 SARS-CoV 和 MERS-CoV[2-3]。而最近发现了一类新型冠状病毒（SARS-CoV-2），被感染的患者临床特征与 SARS 和 MERS 有相似之处[4]，且表现出较大的流行潜力[5]，相关疾病被命名为 COVID-19，中文名称为新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）。
与多数病毒感染疾病的实验室诊断方法类似[6]，SARS-CoV-2 的实验室诊断方法包括针对病毒核酸的定量逆转录聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR），和针对 IgM 和 IgG 抗体的化学发光法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA）、酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）等多种方法[7-8]。核酸检测是最早被认可用于诊断新冠肺炎的方法，而在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版）》中，抗体检测已经被纳入确诊方法之一[9]。GICA 作为一种快速、简便的床旁检测方式，适用于基层及快速筛查。目前，多种 GICA 试剂已或待上市，本研究中，我们着重对三种 GICA 试剂的诊断能力进行探讨。
1 材料与方法
1.1 标本采集
血清标本包括 33 份新冠肺炎确诊患者标本和 45 份排除新冠肺炎患者标本。确诊患者血清标本来源于四川大学华西医院 2020 年 1～2 月确诊的 12 例新冠肺炎患者的不同感染时间点的血清样本，确诊标准依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第六版）》，血清收集时间最早为发病后第 3 天，最晚为发病后第 35 天。排除标本参照新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版），选取于同期 SARS-CoV-2 核酸检测两次阴性（间隔时间 24 h 以上），且 14 d 内无新冠肺炎临床表现（发热、干咳、乏力）的患者标本；其中合并其他呼吸道病毒感染患者样本 21 例（鼻病毒、副流感病毒、博卡病毒、腺病毒和偏肺病毒），人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）患者样本 5 例，高类风湿因子（rheumatoid factor，RF）样本 4 例（RF 分别为 21 IU/mL、242 IU/mL、393 IU/mL、900 IU/mL），黄疸样本、溶血样本以及脂血标本各 5 例。78 份标本均采集全血，3 000 r/min 离心分离血清，严格密封后于–80 ℃ 保存，2 周内检测。
1.2 方法
本研究采用北京热景生物技术有限公司（试剂 A）、广州万孚生物技术有限公司（试剂 B）、成都华西精准医学产业技术有限公司（试剂 C）三种 GICA 法试剂盒分别检测患者血清样本中的 IgM、IgG 和总抗体（IgM 与 IgG 联合检测），见表 1。使用罗氏通用稀释液手工倍比稀释样本，用于滴度检测，稀释滴度为 1∶2、1∶4、1∶8 和 1∶16，其余操作流程遵循试剂说明书，以肉眼可见检测线为阳性。
表1
三种 SARS-CoV-2 检测试剂的基本特征
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件。
2 结果
2.1 特异性抗原、抗体检测结果
采用三种 GICA 法试剂盒检测 78 例样本，敏感性 66.7%～90.9%；特异性最高可达到 100.0%，最低为 73.3%；阳性预测值 71.4%～100.0%，阴性预测值 80.4%～91.7%；漏诊率和误诊率分别为 9.1%～33.3% 和 0～26.7%（表 2）。
表2
三种 GICA 法试剂盒检测 78 份血清标本的能力评价
2.2 抗体检出的影响因素
三种试剂检测 33 份阳性标本，阳性率随稀释滴度的升高而下降（表 3）。试剂 A 的 IgM 在滴度 1∶8 水平时检出率明显下降（χ2=9.58，P=0.002），试剂 A-总抗体试剂 B-总抗体和试剂 C-IgM 随滴度上升，检出率逐渐下降。试剂 C-IgG 检出率下降程度不明显。在 1∶4 的滴度水平，所有试剂的阳性检出率均超过 50%。
表3
三种 GICA 法试剂盒对不同滴度阳性血清标本的检出率（%）
针对 12 例有多次采血时间的患者，检测不同时间点的血清标本，发现随发病时长增加，三种试剂的检出率均有上升，IgG 的检出时长明显长于 IgM 和总抗体。在检测终点时间（35 天），未见 IgM 或 IgG 抗体检出率降低。结果见表 4。
表4
三种 GICA 法试剂盒不同检测时间点阳性血清标本的检出率（%）
对于不同类型的干扰物质，三种试剂的假阳性率不一。试剂 A-IgM 抗体仅在其他病毒感染标本中未见假阳性；试剂 B-总抗体在其他病毒感染、脂血、黄疸标本中未见假阳性；试剂 C-IgM 抗体在 HIV 感染、高 RF 标本中未见假阳性；试剂 A-总抗体和试剂 C-IgG 抗体在所有干扰标本中均未见假阳性。结果见表 5。
表5
三种 GICA 法试剂盒抗干扰能力（%）
2.3 两种 GICA 法试剂联合检测
选用三种 GICA 法试剂中的两种联合检测，以任意一种试剂阳性为抗体阳性，两种试剂均阴性为抗体阴性。诊断性能见表 6。
表6
试剂盒联合检测 78 份血清标本的能力评价
3 讨论
GICA 法快速诊断试剂相比 ELISA 和 CLIA 法，有检测速度快、检测条件要求低等优点，便于床旁检测的开展，且采血对与患者密切接触的医护人员的风险的小于采集咽拭子，对于本次新冠肺炎在人群中的流行病学调查可有较大的帮助。与许多感染相同[10-11]，本次的新冠肺炎患者最早可在发病第 3 天就检测到 IgM 抗体，在第 10 天之后，IgG 抗体检出率也明显增加。抗体窗口期与冠状病毒核酸检测类似[12]，而 GICA 法对样品质量的要求不如基于核酸的检测严格，不管呼吸道样本中是否存在病毒，都可以检测到特定抗体的存在，从而可以避免核酸检测中因采样不符合要求而导致大量假阴性结果[13-14]。
本研究使用的三种试剂分别检测 SARS-CoV-2 的 IgM 抗体、IgG 抗体和总抗体。IgM 抗体的敏感性总体高于 IgG 抗体和总抗体，但同时 IgM 抗体的误诊率也明显较高，阳性预测值较差（71.4% 和 83.3%）。IgG 的检测在特异性和阳性预测值方面表现较好，但敏感性较低，不利于早期诊断。总抗体作为将 IgM 和 IgG 共同检测的方法，在各项评价指标中的结果均较高，总抗体检测的约登指数最高。在临床使用 GICA 试剂的过程中，建议使用总抗体检测试剂，以保证灵敏度和特异性，降低因假阳性和假阴性带来的漏诊和误诊，或将总抗体与 IgG/IgM 抗体联合检测。相比于 IgG 和总抗体，IgM 抗体的检测阳性率随滴度增加，下降更为明显，但所有试剂在均可保证在稀释至 1: 8 时检出率大于 50%。
在 SARS 和 MERS 的研究中，由于针对普通感冒 CoV 的抗体人群中的高血清阳性率，加上针对免疫原性 CoV 蛋白保守部分的抗体交叉反应存在，可能会造成假阳性结果[14-15]，此论点在本次 SARS-CoV-2 中还未进行过研究，但由于 SARS-CoV-2 与 SARS 病毒的同一性较高（约 79%）[16]，产生交叉反应的可能性也存在，为该试剂的假阳性埋下伏笔。据报道，SARS-CoV 的 N 蛋白与人类Ⅰ型冠状病毒 229E，猫传染性腹膜炎病毒和猪传染性胃肠炎病毒等抗原性Ⅰ类动物冠状病毒的抗血清发生抗原性交叉反应。因此，使用完整的 N 蛋白作为抗原进行血清学检测可能会导致特异性和敏感性问题[17]，本研究中三类试剂的 IgM 和总抗体使用 S 蛋白全长和 N 蛋白全长包被，总抗体额外增加 S-SRBD+N 蛋白包被，有造成检测结果假阳性的可能。针对 MERS 的假阳性问题，已经开发出使用 MERS-CoV S 蛋白的 S1 片段作为抗原的无细胞蛋白微阵列，而且竞争法可有效降低抗体检测的假阳性率[18]，但目前 GICA 法还未见竞争法试剂面世，因此我们认为这样的方法可以在 SARS-CoV-2 的后续研究中进行探讨。
高 RF 对三种试剂的干扰均较大，假阳性率最高可达到 60%。RF 是针对 IgG 的可结晶片段区域上的抗原决定簇的自身抗体，因此，RF 可以与捕获抗体（胶体金标记的抗体）结合。通过在条带上捕获抗体，可以很容易地检测到这种抗体复合物，从而导致假阳性[19]，这也是本研究中 IgM 假阳性率高于 IgG 的可能原因。故对于自身免疫病患者，GICA 法的结果判断需要慎重。另外，HIV 感染患者使用 GICA 法检测结果也可能出现假阳性结果，这在其他病毒感染疾病的检测中很少发现，可能是由于 HIV 与 SARS-CoV-2 在基因序列有相似之处，有可能造成交叉反应[20]。在针对临床患者的检测中，需关注患者是否为 HIV 感染者。
除了感染性疾病和自身免疫性疾病产生的交叉反应外，血清标本的质量也对检测结果有一定影响。本研究发现脂血、溶血和黄疸可影响 IgM 的检测，但对 IgG 和总抗体的结果无影响。脂血血清中的脂蛋白可以非特异性地干扰各种类型的免疫检测，主要原因是阻断对应的的结合位点，对于不同性质的免疫反应，干扰可导致结果假阴性或假阳性[21]，相比双抗原夹心法检测 IgG 和总抗体，捕获法更容易受到甘油三酯的影响。溶血和黄疸标本由于血清颜色较深，造成检测条带本底过重，对肉眼检测的结果有较大影响。中和实验在一定程度上可以消除交叉反应，降低假阳性率[14, 18]。
综上，GICA 法快速诊断试剂是一种便捷、安全的检测方式，试剂性能符合筛查实验的要求，对新冠肺炎的检测结果较为可靠。但试剂对标本的要求较高，应特别注意标本前处理，方法易受到多种干扰因素的影响。临床实验室应注意不同试剂在检出能力和潜在交叉反应之间的性能差异，或使用多种抗体联合检测，并制定出合适本实验室的检测策略。本研究有一些局限性。首先，标本数量偏少；其次，暂未考虑流行率对诊断效能的影响。第三，本研究在 HIV 引起的假阳性方面的研究亟待深入，更大的干扰样本量有助于对试剂干扰因素的研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
冠状病毒是属于冠状病毒科的有包膜的非节段的正义 RNA 病毒，包括 CoV-229E、OC43、NL63 和 HKU1，广泛分布于人和其他哺乳动物中[1]，通常引起轻度的呼吸道疾病，但近年发生的重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrom，SARS）和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrom，MERS）也是由冠状病毒引起的，分别为 SARS-CoV 和 MERS-CoV[2-3]。而最近发现了一类新型冠状病毒（SARS-CoV-2），被感染的患者临床特征与 SARS 和 MERS 有相似之处[4]，且表现出较大的流行潜力[5]，相关疾病被命名为 COVID-19，中文名称为新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）。
与多数病毒感染疾病的实验室诊断方法类似[6]，SARS-CoV-2 的实验室诊断方法包括针对病毒核酸的定量逆转录聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR），和针对 IgM 和 IgG 抗体的化学发光法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA）、酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）等多种方法[7-8]。核酸检测是最早被认可用于诊断新冠肺炎的方法，而在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版）》中，抗体检测已经被纳入确诊方法之一[9]。GICA 作为一种快速、简便的床旁检测方式，适用于基层及快速筛查。目前，多种 GICA 试剂已或待上市，本研究中，我们着重对三种 GICA 试剂的诊断能力进行探讨。
1 材料与方法
1.1 标本采集
血清标本包括 33 份新冠肺炎确诊患者标本和 45 份排除新冠肺炎患者标本。确诊患者血清标本来源于四川大学华西医院 2020 年 1～2 月确诊的 12 例新冠肺炎患者的不同感染时间点的血清样本，确诊标准依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第六版）》，血清收集时间最早为发病后第 3 天，最晚为发病后第 35 天。排除标本参照新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版），选取于同期 SARS-CoV-2 核酸检测两次阴性（间隔时间 24 h 以上），且 14 d 内无新冠肺炎临床表现（发热、干咳、乏力）的患者标本；其中合并其他呼吸道病毒感染患者样本 21 例（鼻病毒、副流感病毒、博卡病毒、腺病毒和偏肺病毒），人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）患者样本 5 例，高类风湿因子（rheumatoid factor，RF）样本 4 例（RF 分别为 21 IU/mL、242 IU/mL、393 IU/mL、900 IU/mL），黄疸样本、溶血样本以及脂血标本各 5 例。78 份标本均采集全血，3 000 r/min 离心分离血清，严格密封后于–80 ℃ 保存，2 周内检测。
1.2 方法
本研究采用北京热景生物技术有限公司（试剂 A）、广州万孚生物技术有限公司（试剂 B）、成都华西精准医学产业技术有限公司（试剂 C）三种 GICA 法试剂盒分别检测患者血清样本中的 IgM、IgG 和总抗体（IgM 与 IgG 联合检测），见表 1。使用罗氏通用稀释液手工倍比稀释样本，用于滴度检测，稀释滴度为 1∶2、1∶4、1∶8 和 1∶16，其余操作流程遵循试剂说明书，以肉眼可见检测线为阳性。
表1
三种 SARS-CoV-2 检测试剂的基本特征
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件。
2 结果
2.1 特异性抗原、抗体检测结果
采用三种 GICA 法试剂盒检测 78 例样本，敏感性 66.7%～90.9%；特异性最高可达到 100.0%，最低为 73.3%；阳性预测值 71.4%～100.0%，阴性预测值 80.4%～91.7%；漏诊率和误诊率分别为 9.1%～33.3% 和 0～26.7%（表 2）。
表2
三种 GICA 法试剂盒检测 78 份血清标本的能力评价
2.2 抗体检出的影响因素
三种试剂检测 33 份阳性标本，阳性率随稀释滴度的升高而下降（表 3）。试剂 A 的 IgM 在滴度 1∶8 水平时检出率明显下降（χ2=9.58，P=0.002），试剂 A-总抗体试剂 B-总抗体和试剂 C-IgM 随滴度上升，检出率逐渐下降。试剂 C-IgG 检出率下降程度不明显。在 1∶4 的滴度水平，所有试剂的阳性检出率均超过 50%。
表3
三种 GICA 法试剂盒对不同滴度阳性血清标本的检出率（%）
针对 12 例有多次采血时间的患者，检测不同时间点的血清标本，发现随发病时长增加，三种试剂的检出率均有上升，IgG 的检出时长明显长于 IgM 和总抗体。在检测终点时间（35 天），未见 IgM 或 IgG 抗体检出率降低。结果见表 4。
表4
三种 GICA 法试剂盒不同检测时间点阳性血清标本的检出率（%）
对于不同类型的干扰物质，三种试剂的假阳性率不一。试剂 A-IgM 抗体仅在其他病毒感染标本中未见假阳性；试剂 B-总抗体在其他病毒感染、脂血、黄疸标本中未见假阳性；试剂 C-IgM 抗体在 HIV 感染、高 RF 标本中未见假阳性；试剂 A-总抗体和试剂 C-IgG 抗体在所有干扰标本中均未见假阳性。结果见表 5。
表5
三种 GICA 法试剂盒抗干扰能力（%）
2.3 两种 GICA 法试剂联合检测
选用三种 GICA 法试剂中的两种联合检测，以任意一种试剂阳性为抗体阳性，两种试剂均阴性为抗体阴性。诊断性能见表 6。
表6
试剂盒联合检测 78 份血清标本的能力评价
3 讨论
GICA 法快速诊断试剂相比 ELISA 和 CLIA 法，有检测速度快、检测条件要求低等优点，便于床旁检测的开展，且采血对与患者密切接触的医护人员的风险的小于采集咽拭子，对于本次新冠肺炎在人群中的流行病学调查可有较大的帮助。与许多感染相同[10-11]，本次的新冠肺炎患者最早可在发病第 3 天就检测到 IgM 抗体，在第 10 天之后，IgG 抗体检出率也明显增加。抗体窗口期与冠状病毒核酸检测类似[12]，而 GICA 法对样品质量的要求不如基于核酸的检测严格，不管呼吸道样本中是否存在病毒，都可以检测到特定抗体的存在，从而可以避免核酸检测中因采样不符合要求而导致大量假阴性结果[13-14]。
本研究使用的三种试剂分别检测 SARS-CoV-2 的 IgM 抗体、IgG 抗体和总抗体。IgM 抗体的敏感性总体高于 IgG 抗体和总抗体，但同时 IgM 抗体的误诊率也明显较高，阳性预测值较差（71.4% 和 83.3%）。IgG 的检测在特异性和阳性预测值方面表现较好，但敏感性较低，不利于早期诊断。总抗体作为将 IgM 和 IgG 共同检测的方法，在各项评价指标中的结果均较高，总抗体检测的约登指数最高。在临床使用 GICA 试剂的过程中，建议使用总抗体检测试剂，以保证灵敏度和特异性，降低因假阳性和假阴性带来的漏诊和误诊，或将总抗体与 IgG/IgM 抗体联合检测。相比于 IgG 和总抗体，IgM 抗体的检测阳性率随滴度增加，下降更为明显，但所有试剂在均可保证在稀释至 1: 8 时检出率大于 50%。
在 SARS 和 MERS 的研究中，由于针对普通感冒 CoV 的抗体人群中的高血清阳性率，加上针对免疫原性 CoV 蛋白保守部分的抗体交叉反应存在，可能会造成假阳性结果[14-15]，此论点在本次 SARS-CoV-2 中还未进行过研究，但由于 SARS-CoV-2 与 SARS 病毒的同一性较高（约 79%）[16]，产生交叉反应的可能性也存在，为该试剂的假阳性埋下伏笔。据报道，SARS-CoV 的 N 蛋白与人类Ⅰ型冠状病毒 229E，猫传染性腹膜炎病毒和猪传染性胃肠炎病毒等抗原性Ⅰ类动物冠状病毒的抗血清发生抗原性交叉反应。因此，使用完整的 N 蛋白作为抗原进行血清学检测可能会导致特异性和敏感性问题[17]，本研究中三类试剂的 IgM 和总抗体使用 S 蛋白全长和 N 蛋白全长包被，总抗体额外增加 S-SRBD+N 蛋白包被，有造成检测结果假阳性的可能。针对 MERS 的假阳性问题，已经开发出使用 MERS-CoV S 蛋白的 S1 片段作为抗原的无细胞蛋白微阵列，而且竞争法可有效降低抗体检测的假阳性率[18]，但目前 GICA 法还未见竞争法试剂面世，因此我们认为这样的方法可以在 SARS-CoV-2 的后续研究中进行探讨。
高 RF 对三种试剂的干扰均较大，假阳性率最高可达到 60%。RF 是针对 IgG 的可结晶片段区域上的抗原决定簇的自身抗体，因此，RF 可以与捕获抗体（胶体金标记的抗体）结合。通过在条带上捕获抗体，可以很容易地检测到这种抗体复合物，从而导致假阳性[19]，这也是本研究中 IgM 假阳性率高于 IgG 的可能原因。故对于自身免疫病患者，GICA 法的结果判断需要慎重。另外，HIV 感染患者使用 GICA 法检测结果也可能出现假阳性结果，这在其他病毒感染疾病的检测中很少发现，可能是由于 HIV 与 SARS-CoV-2 在基因序列有相似之处，有可能造成交叉反应[20]。在针对临床患者的检测中，需关注患者是否为 HIV 感染者。
除了感染性疾病和自身免疫性疾病产生的交叉反应外，血清标本的质量也对检测结果有一定影响。本研究发现脂血、溶血和黄疸可影响 IgM 的检测，但对 IgG 和总抗体的结果无影响。脂血血清中的脂蛋白可以非特异性地干扰各种类型的免疫检测，主要原因是阻断对应的的结合位点，对于不同性质的免疫反应，干扰可导致结果假阴性或假阳性[21]，相比双抗原夹心法检测 IgG 和总抗体，捕获法更容易受到甘油三酯的影响。溶血和黄疸标本由于血清颜色较深，造成检测条带本底过重，对肉眼检测的结果有较大影响。中和实验在一定程度上可以消除交叉反应，降低假阳性率[14, 18]。
综上，GICA 法快速诊断试剂是一种便捷、安全的检测方式，试剂性能符合筛查实验的要求，对新冠肺炎的检测结果较为可靠。但试剂对标本的要求较高，应特别注意标本前处理，方法易受到多种干扰因素的影响。临床实验室应注意不同试剂在检出能力和潜在交叉反应之间的性能差异，或使用多种抗体联合检测，并制定出合适本实验室的检测策略。本研究有一些局限性。首先，标本数量偏少；其次，暂未考虑流行率对诊断效能的影响。第三，本研究在 HIV 引起的假阳性方面的研究亟待深入，更大的干扰样本量有助于对试剂干扰因素的研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
