引用本文： 郑琳, 王丽, 毛山, 周丹阳, 谷伟, 史莹. 支气管哮喘患者肝 X 受体、蛋白磷酸酶 1A 的表达及与气道重塑的关系研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(3): 229-233. doi: 10.7507/1671-6205.201905031 复制
支气管哮喘（简称哮喘）是世界范围内患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多数患者从儿童或青少年即开始发病，虽经短期治疗后炎症能够缓解，但气道重塑仍持续存在并进行性发展[2-3]，从而导致气道壁形态学上的改变越来越严重。目前认为气道重塑是造成不可逆性气流阻塞和重症哮喘的病理基础[4]。哮喘气道重塑发病机制较为复杂，目前尚未完全阐明，其中 TGF-β/Smad 信号通路在参与气道重塑过程中发挥了重要的作用[5]。既往的研究着重对 TGF-β/Smad 信号通路和气道重塑的关系进行研究，而对 TGF-β/Smad 通路的调控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A（protein phosphatase 1A，PPM1A）是 TGF-β/Smad 信号通路的重要调控蛋白，能明显抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的增殖及转录反应，终止 TGF-β/Smad 信号活动。PPM1A 失表达能增强 TGF-β 信号通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者体内表达水平的高低可能导致患者气道重塑水平的不同。肝 X 受体（liver X receptors，LXRs）属于Ⅱ型核受体，有 LXRα 和 LXRβ 两个亚型。研究发现 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信号通路的作用[8]。LXRβ 与 TGF-β 受体存在相互作用，LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受体调节的转录反应[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者体内的表达及作用均尚不清楚，本研究拟检测 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表达，了解 LXRs 和 PPM1A 与气道重塑的关系。
1 资料和方法
1.1 临床资料
本研究为前瞻性研究。选取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一医院就诊的哮喘患者 60 例，轻中度哮喘及重症哮喘患者各 30 例。年龄 18 岁以上（包含 18 岁）、75 岁以下，性别、民族不限，符合中华医学会呼吸病学分会制订的《支气管哮喘防治指南》[10]的诊断标准。重症哮喘患者的控制标准按照 GINA 的标准进行综合、全面的评估[11]，符合重症哮喘未控制的常见特征：（1）症状控制差：哮喘控制问卷评分>1.5 分，哮喘控制测试评分<20 分，或符合 GINA 定义的未控制；（2）频繁急性发作：前一年需要 2 次或以上连续使用全身性激素（每次 3 d 以上）；（3）严重急性发作：前一年至少 1 次住院、进入重症加强治疗病房或需要机械通气；（4）持续性气流受限：尽管给予充分的支气管舒张剂治疗，仍存在持续的气流受限，即第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred）<80%，第 1 秒用力呼气容积与用力肺活量的比值（FEV1/FVC）低于正常值下限；（5）高剂量吸入性糖皮质激素或全身性糖皮质激素（或其他生物制剂）可以维持控制，但只要减量哮喘就会加重。轻中度哮喘患者为达不到上述重症标准的患者。选择体检中心健康对照者 30 人。各组在年龄、性别上匹配。本研究获得了南京市第一医院伦理委员会的批准，并获得入选者的知情同意。本研究不存在经济、物质以及社会关系方面的利益冲突。
哮喘组排除标准：排除患慢性阻塞性肺疾病（参照中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》（2013 年修订版）[12]的诊断标准）、支气管扩张、肺结核、肺栓塞、肺动脉高压、间质性肺疾病和支气管肺癌；有过敏性疾病、风湿系统疾病或免疫功能缺陷；依从性差者；4 周内有证据表明有呼吸道感染或相关症状；妊娠或哺乳期女性；近期有丧失行为能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 仪器和试剂
肺功能仪（耶格公司，德国），CT 机（菲利浦公司，荷兰），人 TGF-β1、Smad2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Invitrogen 公司，美国），人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 试剂盒（Abcam 公司，英国），酶标仪（Bio-rad 公司，美国）。
1.2.2 一般资料收集
收集受试者年龄、性别、病程以及吸烟指数等资料。
1.2.3 肺功能检查
所有受试者在入组前检测肺功能，记录 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼气峰流速占预计值百分比（PEF%pred），分析气流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 检查
在入组后使用 GE HD750CT 机对所有受试者进行胸部高分辨率 CT（high-resolution computed tomography，HRCT）扫描。运用薄层技术（1.0 mm 层厚，1.0 mm 间距），选择主动脉弓层面上下各 3 个层面扫描，扫描电压 120 MV、矩阵 512×512，采用骨算法进行重建。对每位患者进行深吸气末屏气相和深呼气末屏气相扫描。参考文献[13]的方法，每个层面选择右肺 2 个影像清晰的气道进行测量，每个气道的每项指标需进行 2 次测量，取平均值作为每次的测量值。测量指标：气道内径（L）、气道外径（D）、气道腔面积（Ai）、气道总面积（Ao）。计算指标：气道壁厚度（T）：（D–L）/2；气道壁面积（WA）：Ao–Ai；气道壁面积占气道总横截面积的百分比（WA%）：（Ao–Ai）/Ao×100%。选用 T/D、WA% 作为气道重塑评价指标。
1.2.5 血清 ELISA 检测
无菌采集外周静脉血 5 mL，乙二胺四乙酸二钠盐抗凝，4 ℃、3 000 r/min 下离心 5 min，分离血清，保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量检测血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步骤严格按照说明书执行，根据吸光度值计算出标本中蛋白水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 12 统计软件。结果以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用成组 t 检验对各组进行比较，P≤0.05 为差异有统计学意义。采用 Pearson 相关分析法进行相关性分析。
2 结果
2.1 受试者一般资料及肺功能
各组年龄、性别、病程及吸烟指数无明显差异（表 1）。轻中度哮喘组较对照组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差异有统计学意义（均 P<0.05），而重症哮喘组较轻中度哮喘组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差异有统计学意义（均 P<0.05），见表 2。
表1
受试者一般资料（n=30）
表2
受试者肺功能情况（n=30，
）
2.2 受试者气道重塑情况
HRCT 测定支气管气道壁面积和厚度，轻中度哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于对照组，差异有统计学意义（均 P<0.05），重症哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于轻中度哮喘组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。结果见表 3。
表3
HRCT 测定的支气管气道壁面积和厚度（n=30，
）
2.3 受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
轻中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值较对照组明显增高，差异有统计学意义（均 P<0.05），重症哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 较对照组明显增高，差异有统计学意义（均 P<0.05），但轻中度哮喘组及重症哮喘组之间无明显差异。轻中度哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于对照组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。而重症哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于轻中度哮喘组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。轻中度哮喘组的 PPM1A 明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而重症哮喘组的血清 PPM1A 较轻中度哮喘组明显降低（P<0.05）。结果见表 4。
表4
受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平（n=30，
）
2.4 相关性分析
对 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 进行相关性分析，结果提示：TGF-β1 与 T/D 和 WA% 呈正相关，r 分别为 0.452 及 0.514。Smad2 与 T/D 及 WA% 呈正相关，r 分别为 0.418 及 0.477。PPM1A 与 T/D 及 WA% 呈负相关，r 分别为 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 与 T/D 及 WA% 均无相关性，均 P>0.05。
3 讨论
本研究以我院呼吸与危重症医学科门诊就诊的哮喘患者为研究对象，通过检测哮喘患者胸部 HRCT 来判断患者气道重塑水平，同时检测外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平，并进一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 与气道重塑的关系。HRCT 被用于评估哮喘患者的气道重塑程度，可识别 100～200 μm 的结构，显示直径 1.5～2 mm 的气道，相对支气管镜检查更简单无创[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 试剂盒均可购买获得，从而确保了研究的顺利开展。本研究结果显示，哮喘患者存在不同程度的气道重塑，重症哮喘患者气道重塑程度较轻中度哮喘患者气道重塑水平更高。此外，哮喘患者 PPM1A 表达较健康人降低，提示其与哮喘患者气道重塑程度有关。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信号通路重要的调控蛋白，能终止 TGF-β 信号传导[14]。哮喘患者血清 PPM1A 较健康者表达减少，且与气道重塑水平呈负相关。推测哮喘患者体内低水平的 PPM1A 有可能导致机体 TGF-β/Smad 信号通路的作用增强，可能导致是哮喘患者气道重塑的原因之一。此外，重症哮喘患者的 PPM1A 水平较其他受试者低，而 TGF-β/Smad 水平较其他受试者高，可能是其气道重塑较严重的原因。
本研究检测了 LXRs 在哮喘患者血清中的表达水平。LXRs 是核受体，活化后有抑制 TGF-β/Smad 信号传导的作用[15]，并能抑制哮喘动物模型的 IgE 生成及气道重塑[16-17]。我们的研究发现，哮喘患者血清 LXRs 水平较健康者增高，提示 LXRs 可能在哮喘的慢性气道炎症过程中反应性增高。但重症哮喘患者和轻中度哮喘患者之间 LXRs 表达无差异，因而 LXRs 水平高低无法反映哮喘气道重塑的严重程度。由于 LXRs 的功能主要由配体激活所致，而目前尚不清楚哮喘患者体内 LXRs 配体的种类，加上我们的研究未对 LXRs 是否被活化进行检测，因此其抑制气道重塑的机制尚仍待进一步研究。
综上所述，哮喘患者气道中 TGF-β/Smad 的表达水平较健康人增加，PPM1A 表达较健康人降低，可能与气道重塑有关。哮喘患者 LXRs 表达较健康者增高，但与气道重塑无相关性。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘（简称哮喘）是世界范围内患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多数患者从儿童或青少年即开始发病，虽经短期治疗后炎症能够缓解，但气道重塑仍持续存在并进行性发展[2-3]，从而导致气道壁形态学上的改变越来越严重。目前认为气道重塑是造成不可逆性气流阻塞和重症哮喘的病理基础[4]。哮喘气道重塑发病机制较为复杂，目前尚未完全阐明，其中 TGF-β/Smad 信号通路在参与气道重塑过程中发挥了重要的作用[5]。既往的研究着重对 TGF-β/Smad 信号通路和气道重塑的关系进行研究，而对 TGF-β/Smad 通路的调控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A（protein phosphatase 1A，PPM1A）是 TGF-β/Smad 信号通路的重要调控蛋白，能明显抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的增殖及转录反应，终止 TGF-β/Smad 信号活动。PPM1A 失表达能增强 TGF-β 信号通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者体内表达水平的高低可能导致患者气道重塑水平的不同。肝 X 受体（liver X receptors，LXRs）属于Ⅱ型核受体，有 LXRα 和 LXRβ 两个亚型。研究发现 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信号通路的作用[8]。LXRβ 与 TGF-β 受体存在相互作用，LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受体调节的转录反应[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者体内的表达及作用均尚不清楚，本研究拟检测 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表达，了解 LXRs 和 PPM1A 与气道重塑的关系。
1 资料和方法
1.1 临床资料
本研究为前瞻性研究。选取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一医院就诊的哮喘患者 60 例，轻中度哮喘及重症哮喘患者各 30 例。年龄 18 岁以上（包含 18 岁）、75 岁以下，性别、民族不限，符合中华医学会呼吸病学分会制订的《支气管哮喘防治指南》[10]的诊断标准。重症哮喘患者的控制标准按照 GINA 的标准进行综合、全面的评估[11]，符合重症哮喘未控制的常见特征：（1）症状控制差：哮喘控制问卷评分>1.5 分，哮喘控制测试评分<20 分，或符合 GINA 定义的未控制；（2）频繁急性发作：前一年需要 2 次或以上连续使用全身性激素（每次 3 d 以上）；（3）严重急性发作：前一年至少 1 次住院、进入重症加强治疗病房或需要机械通气；（4）持续性气流受限：尽管给予充分的支气管舒张剂治疗，仍存在持续的气流受限，即第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred）<80%，第 1 秒用力呼气容积与用力肺活量的比值（FEV1/FVC）低于正常值下限；（5）高剂量吸入性糖皮质激素或全身性糖皮质激素（或其他生物制剂）可以维持控制，但只要减量哮喘就会加重。轻中度哮喘患者为达不到上述重症标准的患者。选择体检中心健康对照者 30 人。各组在年龄、性别上匹配。本研究获得了南京市第一医院伦理委员会的批准，并获得入选者的知情同意。本研究不存在经济、物质以及社会关系方面的利益冲突。
哮喘组排除标准：排除患慢性阻塞性肺疾病（参照中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》（2013 年修订版）[12]的诊断标准）、支气管扩张、肺结核、肺栓塞、肺动脉高压、间质性肺疾病和支气管肺癌；有过敏性疾病、风湿系统疾病或免疫功能缺陷；依从性差者；4 周内有证据表明有呼吸道感染或相关症状；妊娠或哺乳期女性；近期有丧失行为能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 仪器和试剂
肺功能仪（耶格公司，德国），CT 机（菲利浦公司，荷兰），人 TGF-β1、Smad2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Invitrogen 公司，美国），人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 试剂盒（Abcam 公司，英国），酶标仪（Bio-rad 公司，美国）。
1.2.2 一般资料收集
收集受试者年龄、性别、病程以及吸烟指数等资料。
1.2.3 肺功能检查
所有受试者在入组前检测肺功能，记录 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼气峰流速占预计值百分比（PEF%pred），分析气流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 检查
在入组后使用 GE HD750CT 机对所有受试者进行胸部高分辨率 CT（high-resolution computed tomography，HRCT）扫描。运用薄层技术（1.0 mm 层厚，1.0 mm 间距），选择主动脉弓层面上下各 3 个层面扫描，扫描电压 120 MV、矩阵 512×512，采用骨算法进行重建。对每位患者进行深吸气末屏气相和深呼气末屏气相扫描。参考文献[13]的方法，每个层面选择右肺 2 个影像清晰的气道进行测量，每个气道的每项指标需进行 2 次测量，取平均值作为每次的测量值。测量指标：气道内径（L）、气道外径（D）、气道腔面积（Ai）、气道总面积（Ao）。计算指标：气道壁厚度（T）：（D–L）/2；气道壁面积（WA）：Ao–Ai；气道壁面积占气道总横截面积的百分比（WA%）：（Ao–Ai）/Ao×100%。选用 T/D、WA% 作为气道重塑评价指标。
1.2.5 血清 ELISA 检测
无菌采集外周静脉血 5 mL，乙二胺四乙酸二钠盐抗凝，4 ℃、3 000 r/min 下离心 5 min，分离血清，保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量检测血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步骤严格按照说明书执行，根据吸光度值计算出标本中蛋白水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 12 统计软件。结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用成组 t 检验对各组进行比较，P≤0.05 为差异有统计学意义。采用 Pearson 相关分析法进行相关性分析。
2 结果
2.1 受试者一般资料及肺功能
各组年龄、性别、病程及吸烟指数无明显差异（表 1）。轻中度哮喘组较对照组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差异有统计学意义（均 P<0.05），而重症哮喘组较轻中度哮喘组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差异有统计学意义（均 P<0.05），见表 2。
表1
受试者一般资料（n=30）
表2
受试者肺功能情况（n=30，）
2.2 受试者气道重塑情况
HRCT 测定支气管气道壁面积和厚度，轻中度哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于对照组，差异有统计学意义（均 P<0.05），重症哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于轻中度哮喘组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。结果见表 3。
表3
HRCT 测定的支气管气道壁面积和厚度（n=30，）
2.3 受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
轻中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值较对照组明显增高，差异有统计学意义（均 P<0.05），重症哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 较对照组明显增高，差异有统计学意义（均 P<0.05），但轻中度哮喘组及重症哮喘组之间无明显差异。轻中度哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于对照组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。而重症哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于轻中度哮喘组，差异有统计学意义（均 P<0.05）。轻中度哮喘组的 PPM1A 明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而重症哮喘组的血清 PPM1A 较轻中度哮喘组明显降低（P<0.05）。结果见表 4。
表4
受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平（n=30，）
2.4 相关性分析
对 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 进行相关性分析，结果提示：TGF-β1 与 T/D 和 WA% 呈正相关，r 分别为 0.452 及 0.514。Smad2 与 T/D 及 WA% 呈正相关，r 分别为 0.418 及 0.477。PPM1A 与 T/D 及 WA% 呈负相关，r 分别为 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 与 T/D 及 WA% 均无相关性，均 P>0.05。
3 讨论
本研究以我院呼吸与危重症医学科门诊就诊的哮喘患者为研究对象，通过检测哮喘患者胸部 HRCT 来判断患者气道重塑水平，同时检测外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平，并进一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 与气道重塑的关系。HRCT 被用于评估哮喘患者的气道重塑程度，可识别 100～200 μm 的结构，显示直径 1.5～2 mm 的气道，相对支气管镜检查更简单无创[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 试剂盒均可购买获得，从而确保了研究的顺利开展。本研究结果显示，哮喘患者存在不同程度的气道重塑，重症哮喘患者气道重塑程度较轻中度哮喘患者气道重塑水平更高。此外，哮喘患者 PPM1A 表达较健康人降低，提示其与哮喘患者气道重塑程度有关。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信号通路重要的调控蛋白，能终止 TGF-β 信号传导[14]。哮喘患者血清 PPM1A 较健康者表达减少，且与气道重塑水平呈负相关。推测哮喘患者体内低水平的 PPM1A 有可能导致机体 TGF-β/Smad 信号通路的作用增强，可能导致是哮喘患者气道重塑的原因之一。此外，重症哮喘患者的 PPM1A 水平较其他受试者低，而 TGF-β/Smad 水平较其他受试者高，可能是其气道重塑较严重的原因。
本研究检测了 LXRs 在哮喘患者血清中的表达水平。LXRs 是核受体，活化后有抑制 TGF-β/Smad 信号传导的作用[15]，并能抑制哮喘动物模型的 IgE 生成及气道重塑[16-17]。我们的研究发现，哮喘患者血清 LXRs 水平较健康者增高，提示 LXRs 可能在哮喘的慢性气道炎症过程中反应性增高。但重症哮喘患者和轻中度哮喘患者之间 LXRs 表达无差异，因而 LXRs 水平高低无法反映哮喘气道重塑的严重程度。由于 LXRs 的功能主要由配体激活所致，而目前尚不清楚哮喘患者体内 LXRs 配体的种类，加上我们的研究未对 LXRs 是否被活化进行检测，因此其抑制气道重塑的机制尚仍待进一步研究。
综上所述，哮喘患者气道中 TGF-β/Smad 的表达水平较健康人增加，PPM1A 表达较健康人降低，可能与气道重塑有关。哮喘患者 LXRs 表达较健康者增高，但与气道重塑无相关性。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
