引用本文: 郑琳, 王丽, 毛山, 周丹阳, 谷伟, 史莹. 支气管哮喘患者肝 X 受体、蛋白磷酸酶 1A 的表达及与气道重塑的关系研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(3): 229-233. doi: 10.7507/1671-6205.201905031 复制
支气管哮喘(简称哮喘)是世界范围内患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多数患者从儿童或青少年即开始发病,虽经短期治疗后炎症能够缓解,但气道重塑仍持续存在并进行性发展[2-3],从而导致气道壁形态学上的改变越来越严重。目前认为气道重塑是造成不可逆性气流阻塞和重症哮喘的病理基础[4]。哮喘气道重塑发病机制较为复杂,目前尚未完全阐明,其中 TGF-β/Smad 信号通路在参与气道重塑过程中发挥了重要的作用[5]。既往的研究着重对 TGF-β/Smad 信号通路和气道重塑的关系进行研究,而对 TGF-β/Smad 通路的调控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A(protein phosphatase 1A,PPM1A)是 TGF-β/Smad 信号通路的重要调控蛋白,能明显抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)引起的增殖及转录反应,终止 TGF-β/Smad 信号活动。PPM1A 失表达能增强 TGF-β 信号通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者体内表达水平的高低可能导致患者气道重塑水平的不同。肝 X 受体(liver X receptors,LXRs)属于Ⅱ型核受体,有 LXRα 和 LXRβ 两个亚型。研究发现 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信号通路的作用[8]。LXRβ 与 TGF-β 受体存在相互作用,LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受体调节的转录反应[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者体内的表达及作用均尚不清楚,本研究拟检测 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表达,了解 LXRs 和 PPM1A 与气道重塑的关系。
1 资料和方法
1.1 临床资料
本研究为前瞻性研究。选取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一医院就诊的哮喘患者 60 例,轻中度哮喘及重症哮喘患者各 30 例。年龄 18 岁以上(包含 18 岁)、75 岁以下,性别、民族不限,符合中华医学会呼吸病学分会制订的《支气管哮喘防治指南》[10]的诊断标准。重症哮喘患者的控制标准按照 GINA 的标准进行综合、全面的评估[11],符合重症哮喘未控制的常见特征:(1)症状控制差:哮喘控制问卷评分>1.5 分,哮喘控制测试评分<20 分,或符合 GINA 定义的未控制;(2)频繁急性发作:前一年需要 2 次或以上连续使用全身性激素(每次 3 d 以上);(3)严重急性发作:前一年至少 1 次住院、进入重症加强治疗病房或需要机械通气;(4)持续性气流受限:尽管给予充分的支气管舒张剂治疗,仍存在持续的气流受限,即第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%pred)<80%,第 1 秒用力呼气容积与用力肺活量的比值(FEV1/FVC)低于正常值下限;(5)高剂量吸入性糖皮质激素或全身性糖皮质激素(或其他生物制剂)可以维持控制,但只要减量哮喘就会加重。轻中度哮喘患者为达不到上述重症标准的患者。选择体检中心健康对照者 30 人。各组在年龄、性别上匹配。本研究获得了南京市第一医院伦理委员会的批准,并获得入选者的知情同意。本研究不存在经济、物质以及社会关系方面的利益冲突。
哮喘组排除标准:排除患慢性阻塞性肺疾病(参照中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013 年修订版)[12]的诊断标准)、支气管扩张、肺结核、肺栓塞、肺动脉高压、间质性肺疾病和支气管肺癌;有过敏性疾病、风湿系统疾病或免疫功能缺陷;依从性差者;4 周内有证据表明有呼吸道感染或相关症状;妊娠或哺乳期女性;近期有丧失行为能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 仪器和试剂
肺功能仪(耶格公司,德国),CT 机(菲利浦公司,荷兰),人 TGF-β1、Smad2 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(Invitrogen 公司,美国),人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 试剂盒(Abcam 公司,英国),酶标仪(Bio-rad 公司,美国)。
1.2.2 一般资料收集
收集受试者年龄、性别、病程以及吸烟指数等资料。
1.2.3 肺功能检查
所有受试者在入组前检测肺功能,记录 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼气峰流速占预计值百分比(PEF%pred),分析气流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 检查
在入组后使用 GE HD750CT 机对所有受试者进行胸部高分辨率 CT(high-resolution computed tomography,HRCT)扫描。运用薄层技术(1.0 mm 层厚,1.0 mm 间距),选择主动脉弓层面上下各 3 个层面扫描,扫描电压 120 MV、矩阵 512×512,采用骨算法进行重建。对每位患者进行深吸气末屏气相和深呼气末屏气相扫描。参考文献[13]的方法,每个层面选择右肺 2 个影像清晰的气道进行测量,每个气道的每项指标需进行 2 次测量,取平均值作为每次的测量值。测量指标:气道内径(L)、气道外径(D)、气道腔面积(Ai)、气道总面积(Ao)。计算指标:气道壁厚度(T):(D–L)/2;气道壁面积(WA):Ao–Ai;气道壁面积占气道总横截面积的百分比(WA%):(Ao–Ai)/Ao×100%。选用 T/D、WA% 作为气道重塑评价指标。
1.2.5 血清 ELISA 检测
无菌采集外周静脉血 5 mL,乙二胺四乙酸二钠盐抗凝,4 ℃、3 000 r/min 下离心 5 min,分离血清,保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量检测血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步骤严格按照说明书执行,根据吸光度值计算出标本中蛋白水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 12 统计软件。结果以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,采用成组 t 检验对各组进行比较,P≤0.05 为差异有统计学意义。采用 Pearson 相关分析法进行相关性分析。
2 结果
2.1 受试者一般资料及肺功能
各组年龄、性别、病程及吸烟指数无明显差异(表 1)。轻中度哮喘组较对照组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低,差异有统计学意义(均 P<0.05),而重症哮喘组较轻中度哮喘组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低,差异有统计学意义(均 P<0.05),见表 2。



2.2 受试者气道重塑情况
HRCT 测定支气管气道壁面积和厚度,轻中度哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于对照组,差异有统计学意义(均 P<0.05),重症哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于轻中度哮喘组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。结果见表 3。


2.3 受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
轻中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值较对照组明显增高,差异有统计学意义(均 P<0.05),重症哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 较对照组明显增高,差异有统计学意义(均 P<0.05),但轻中度哮喘组及重症哮喘组之间无明显差异。轻中度哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于对照组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。而重症哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于轻中度哮喘组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。轻中度哮喘组的 PPM1A 明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而重症哮喘组的血清 PPM1A 较轻中度哮喘组明显降低(P<0.05)。结果见表 4。


2.4 相关性分析
对 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 进行相关性分析,结果提示:TGF-β1 与 T/D 和 WA% 呈正相关,r 分别为 0.452 及 0.514。Smad2 与 T/D 及 WA% 呈正相关,r 分别为 0.418 及 0.477。PPM1A 与 T/D 及 WA% 呈负相关,r 分别为 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 与 T/D 及 WA% 均无相关性,均 P>0.05。
3 讨论
本研究以我院呼吸与危重症医学科门诊就诊的哮喘患者为研究对象,通过检测哮喘患者胸部 HRCT 来判断患者气道重塑水平,同时检测外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平,并进一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 与气道重塑的关系。HRCT 被用于评估哮喘患者的气道重塑程度,可识别 100~200 μm 的结构,显示直径 1.5~2 mm 的气道,相对支气管镜检查更简单无创[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 试剂盒均可购买获得,从而确保了研究的顺利开展。本研究结果显示,哮喘患者存在不同程度的气道重塑,重症哮喘患者气道重塑程度较轻中度哮喘患者气道重塑水平更高。此外,哮喘患者 PPM1A 表达较健康人降低,提示其与哮喘患者气道重塑程度有关。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信号通路重要的调控蛋白,能终止 TGF-β 信号传导[14]。哮喘患者血清 PPM1A 较健康者表达减少,且与气道重塑水平呈负相关。推测哮喘患者体内低水平的 PPM1A 有可能导致机体 TGF-β/Smad 信号通路的作用增强,可能导致是哮喘患者气道重塑的原因之一。此外,重症哮喘患者的 PPM1A 水平较其他受试者低,而 TGF-β/Smad 水平较其他受试者高,可能是其气道重塑较严重的原因。
本研究检测了 LXRs 在哮喘患者血清中的表达水平。LXRs 是核受体,活化后有抑制 TGF-β/Smad 信号传导的作用[15],并能抑制哮喘动物模型的 IgE 生成及气道重塑[16-17]。我们的研究发现,哮喘患者血清 LXRs 水平较健康者增高,提示 LXRs 可能在哮喘的慢性气道炎症过程中反应性增高。但重症哮喘患者和轻中度哮喘患者之间 LXRs 表达无差异,因而 LXRs 水平高低无法反映哮喘气道重塑的严重程度。由于 LXRs 的功能主要由配体激活所致,而目前尚不清楚哮喘患者体内 LXRs 配体的种类,加上我们的研究未对 LXRs 是否被活化进行检测,因此其抑制气道重塑的机制尚仍待进一步研究。
综上所述,哮喘患者气道中 TGF-β/Smad 的表达水平较健康人增加,PPM1A 表达较健康人降低,可能与气道重塑有关。哮喘患者 LXRs 表达较健康者增高,但与气道重塑无相关性。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘(简称哮喘)是世界范围内患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多数患者从儿童或青少年即开始发病,虽经短期治疗后炎症能够缓解,但气道重塑仍持续存在并进行性发展[2-3],从而导致气道壁形态学上的改变越来越严重。目前认为气道重塑是造成不可逆性气流阻塞和重症哮喘的病理基础[4]。哮喘气道重塑发病机制较为复杂,目前尚未完全阐明,其中 TGF-β/Smad 信号通路在参与气道重塑过程中发挥了重要的作用[5]。既往的研究着重对 TGF-β/Smad 信号通路和气道重塑的关系进行研究,而对 TGF-β/Smad 通路的调控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A(protein phosphatase 1A,PPM1A)是 TGF-β/Smad 信号通路的重要调控蛋白,能明显抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)引起的增殖及转录反应,终止 TGF-β/Smad 信号活动。PPM1A 失表达能增强 TGF-β 信号通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者体内表达水平的高低可能导致患者气道重塑水平的不同。肝 X 受体(liver X receptors,LXRs)属于Ⅱ型核受体,有 LXRα 和 LXRβ 两个亚型。研究发现 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信号通路的作用[8]。LXRβ 与 TGF-β 受体存在相互作用,LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受体调节的转录反应[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者体内的表达及作用均尚不清楚,本研究拟检测 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表达,了解 LXRs 和 PPM1A 与气道重塑的关系。
1 资料和方法
1.1 临床资料
本研究为前瞻性研究。选取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一医院就诊的哮喘患者 60 例,轻中度哮喘及重症哮喘患者各 30 例。年龄 18 岁以上(包含 18 岁)、75 岁以下,性别、民族不限,符合中华医学会呼吸病学分会制订的《支气管哮喘防治指南》[10]的诊断标准。重症哮喘患者的控制标准按照 GINA 的标准进行综合、全面的评估[11],符合重症哮喘未控制的常见特征:(1)症状控制差:哮喘控制问卷评分>1.5 分,哮喘控制测试评分<20 分,或符合 GINA 定义的未控制;(2)频繁急性发作:前一年需要 2 次或以上连续使用全身性激素(每次 3 d 以上);(3)严重急性发作:前一年至少 1 次住院、进入重症加强治疗病房或需要机械通气;(4)持续性气流受限:尽管给予充分的支气管舒张剂治疗,仍存在持续的气流受限,即第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%pred)<80%,第 1 秒用力呼气容积与用力肺活量的比值(FEV1/FVC)低于正常值下限;(5)高剂量吸入性糖皮质激素或全身性糖皮质激素(或其他生物制剂)可以维持控制,但只要减量哮喘就会加重。轻中度哮喘患者为达不到上述重症标准的患者。选择体检中心健康对照者 30 人。各组在年龄、性别上匹配。本研究获得了南京市第一医院伦理委员会的批准,并获得入选者的知情同意。本研究不存在经济、物质以及社会关系方面的利益冲突。
哮喘组排除标准:排除患慢性阻塞性肺疾病(参照中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013 年修订版)[12]的诊断标准)、支气管扩张、肺结核、肺栓塞、肺动脉高压、间质性肺疾病和支气管肺癌;有过敏性疾病、风湿系统疾病或免疫功能缺陷;依从性差者;4 周内有证据表明有呼吸道感染或相关症状;妊娠或哺乳期女性;近期有丧失行为能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 仪器和试剂
肺功能仪(耶格公司,德国),CT 机(菲利浦公司,荷兰),人 TGF-β1、Smad2 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(Invitrogen 公司,美国),人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 试剂盒(Abcam 公司,英国),酶标仪(Bio-rad 公司,美国)。
1.2.2 一般资料收集
收集受试者年龄、性别、病程以及吸烟指数等资料。
1.2.3 肺功能检查
所有受试者在入组前检测肺功能,记录 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼气峰流速占预计值百分比(PEF%pred),分析气流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 检查
在入组后使用 GE HD750CT 机对所有受试者进行胸部高分辨率 CT(high-resolution computed tomography,HRCT)扫描。运用薄层技术(1.0 mm 层厚,1.0 mm 间距),选择主动脉弓层面上下各 3 个层面扫描,扫描电压 120 MV、矩阵 512×512,采用骨算法进行重建。对每位患者进行深吸气末屏气相和深呼气末屏气相扫描。参考文献[13]的方法,每个层面选择右肺 2 个影像清晰的气道进行测量,每个气道的每项指标需进行 2 次测量,取平均值作为每次的测量值。测量指标:气道内径(L)、气道外径(D)、气道腔面积(Ai)、气道总面积(Ao)。计算指标:气道壁厚度(T):(D–L)/2;气道壁面积(WA):Ao–Ai;气道壁面积占气道总横截面积的百分比(WA%):(Ao–Ai)/Ao×100%。选用 T/D、WA% 作为气道重塑评价指标。
1.2.5 血清 ELISA 检测
无菌采集外周静脉血 5 mL,乙二胺四乙酸二钠盐抗凝,4 ℃、3 000 r/min 下离心 5 min,分离血清,保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量检测血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步骤严格按照说明书执行,根据吸光度值计算出标本中蛋白水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 12 统计软件。结果以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,采用成组 t 检验对各组进行比较,P≤0.05 为差异有统计学意义。采用 Pearson 相关分析法进行相关性分析。
2 结果
2.1 受试者一般资料及肺功能
各组年龄、性别、病程及吸烟指数无明显差异(表 1)。轻中度哮喘组较对照组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低,差异有统计学意义(均 P<0.05),而重症哮喘组较轻中度哮喘组的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低,差异有统计学意义(均 P<0.05),见表 2。



2.2 受试者气道重塑情况
HRCT 测定支气管气道壁面积和厚度,轻中度哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于对照组,差异有统计学意义(均 P<0.05),重症哮喘组的 T/D 及 WA% 明显高于轻中度哮喘组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。结果见表 3。


2.3 受试者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
轻中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值较对照组明显增高,差异有统计学意义(均 P<0.05),重症哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 较对照组明显增高,差异有统计学意义(均 P<0.05),但轻中度哮喘组及重症哮喘组之间无明显差异。轻中度哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于对照组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。而重症哮喘组的 TGF-β1 及 Smad2 明显高于轻中度哮喘组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。轻中度哮喘组的 PPM1A 明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而重症哮喘组的血清 PPM1A 较轻中度哮喘组明显降低(P<0.05)。结果见表 4。


2.4 相关性分析
对 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 进行相关性分析,结果提示:TGF-β1 与 T/D 和 WA% 呈正相关,r 分别为 0.452 及 0.514。Smad2 与 T/D 及 WA% 呈正相关,r 分别为 0.418 及 0.477。PPM1A 与 T/D 及 WA% 呈负相关,r 分别为 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 与 T/D 及 WA% 均无相关性,均 P>0.05。
3 讨论
本研究以我院呼吸与危重症医学科门诊就诊的哮喘患者为研究对象,通过检测哮喘患者胸部 HRCT 来判断患者气道重塑水平,同时检测外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平,并进一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 与气道重塑的关系。HRCT 被用于评估哮喘患者的气道重塑程度,可识别 100~200 μm 的结构,显示直径 1.5~2 mm 的气道,相对支气管镜检查更简单无创[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 试剂盒均可购买获得,从而确保了研究的顺利开展。本研究结果显示,哮喘患者存在不同程度的气道重塑,重症哮喘患者气道重塑程度较轻中度哮喘患者气道重塑水平更高。此外,哮喘患者 PPM1A 表达较健康人降低,提示其与哮喘患者气道重塑程度有关。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信号通路重要的调控蛋白,能终止 TGF-β 信号传导[14]。哮喘患者血清 PPM1A 较健康者表达减少,且与气道重塑水平呈负相关。推测哮喘患者体内低水平的 PPM1A 有可能导致机体 TGF-β/Smad 信号通路的作用增强,可能导致是哮喘患者气道重塑的原因之一。此外,重症哮喘患者的 PPM1A 水平较其他受试者低,而 TGF-β/Smad 水平较其他受试者高,可能是其气道重塑较严重的原因。
本研究检测了 LXRs 在哮喘患者血清中的表达水平。LXRs 是核受体,活化后有抑制 TGF-β/Smad 信号传导的作用[15],并能抑制哮喘动物模型的 IgE 生成及气道重塑[16-17]。我们的研究发现,哮喘患者血清 LXRs 水平较健康者增高,提示 LXRs 可能在哮喘的慢性气道炎症过程中反应性增高。但重症哮喘患者和轻中度哮喘患者之间 LXRs 表达无差异,因而 LXRs 水平高低无法反映哮喘气道重塑的严重程度。由于 LXRs 的功能主要由配体激活所致,而目前尚不清楚哮喘患者体内 LXRs 配体的种类,加上我们的研究未对 LXRs 是否被活化进行检测,因此其抑制气道重塑的机制尚仍待进一步研究。
综上所述,哮喘患者气道中 TGF-β/Smad 的表达水平较健康人增加,PPM1A 表达较健康人降低,可能与气道重塑有关。哮喘患者 LXRs 表达较健康者增高,但与气道重塑无相关性。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。