引用本文： 张嘉宾, 戈艳蕾, 刘聪辉, 张盼盼, 王红阳, 朱晓颖, 李洪力, 李真真. 慢性间歇低氧大鼠肺组织中 C/EBP 同源蛋白的表达变化及依达拉奉的干预作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(4): 327-330. doi: 10.7507/1671-6205.201809023 复制
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是呼吸科的一种常见慢性疾病，也是一种常见的睡眠障碍性疾病[1-2]。OSAHS 患者特征性夜间反复低氧复氧，使人体处于慢性间歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）状态，可引起全身多个脏器功能的严重损伤，如高血压、冠心病、心律失常、脑血管意外、糖与脂类代谢紊乱及肺动脉高压等[3-6]。但其具体发病机制尚不十分明确。因此，本研究通过建立 28 天间歇低氧大鼠模型，模拟 OSAHS 患者 CIH 状态，观察阻塞性睡眠呼吸暂停模式间歇低氧大鼠肺组织病理变化。此外，研究显示在正常情况下 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在细胞中很少表达，但在缺氧条件下其表达会上调[7-10]。因此，本研究应用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白，探讨 CHOP 蛋白在间歇低氧大鼠肺组织的表达变化，以及依达拉奉的干预作用，为 OSAHS 对人体肺组织影响的发生机制及依达拉奉的干预作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
采用随机数字表法将 120 只成年雄性 Wistar 大鼠分成正常对照组（UC 组）、慢性间歇低氧组（CIH 组）、依达拉奉干预组（NE 组）和生理盐水组（NS 组）。参照文献[11]制备间歇低氧大鼠模型。每日上午 7 时，将 UC 组放置于与 CIH 组相同的有机玻璃饲养箱内，持续注入空气 120 s，氧气（O2）体积分数维持在 210 mL/L，控制流速压力为 0.8 MPa。将 CIH 组置于有机玻璃饲养箱内，首先给予氮气（N2）30 s 使 O2 体积分数低至 50 mL/L，流速压力为 0.15 MPa，其次注入空气 40 s 恢复 O2 体积分数至 210 mL/L，流速压力控制在 0.8 MPa，然后继续注入空气 50 s 使 O2 体积分数维持在 210 mL/L，流速压力为 0.8 MPa，使低氧箱内 O2 体积分数在 50～210 mL/L 之间形成周期交替，每 120 s 为 1 个循环周期，造成间歇低氧环境；NE 组和 NS 组除暴露于同上的 CIH 组环境外，NE 组每日给予依达拉奉（3 mg/kg）尾静脉注射；NS 组每日给予等量生理盐水注射。各组大鼠生活条件及饲养条件相同。各组分别在建立模型的第 3、7、14、21、28 d 处死大鼠。本实验经本院实验动物伦理委员会批准（LX2018151）。
1.2 方法
各组大鼠均经腹腔麻醉后开胸，生理盐水快速将心、肺血管冲洗干净，取出双肺，将左侧肺浸入 4% 多聚甲醛中固定，随后进行石蜡包埋、切片，用于苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫组织化学法染色。固定包埋后肺组织切片，再经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、HE 染色，逐步染色后光镜下观察肺组织病理形态变化。
采用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 的表达，光学显微镜下观察细胞胞浆呈棕黄色或浅黄色为阳性细胞，提示 CHOP 蛋白的表达。各组大鼠随机抽取 3 张切片，按照免疫组织化学法试剂盒说明书进行操作。运用 Motic 医学图像分析系统对结果进行分析，以每张切片的积分光密度（integral optical density，IOD）值代表蛋白相对表达水平，检测 IOD 值，并做好统计。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 16.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，同一组间及同一时间点多组间比较采用单因素方差分析，经检验有统计学意义后用最小显著差异法进行两两比较。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织形态变化
UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变。CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现明显水肿、充血，肺泡间隔增宽，局部可见炎性细胞浸润；且随间歇低氧时间延长，肺组织损伤呈加重趋势。但 NE 组大鼠肺组织损伤程度明显轻于 CIH 组及 NS 组。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理学检查像（HE×400）
a. UC 组；b. CIH 组；c. NE 组；d. NS 组。UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变；CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现水肿、充血，肺泡间隔增宽，局部可见炎性细胞浸润；NE 组大鼠肺组织损伤程度轻于 CIH 组及 NS 组
2.2 大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达
免疫组织化学染色结果显示 UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达，而 CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞增多，且随时间延长，阳性细胞表达增多；NE 组阳性细胞的表达低于 CIH 组及 NS 组。图像分析结果显示，与 UC 组比较，CIH 组 CHOP 蛋白 IOD 值升高（P<0.05）；与 CIH 组比较，NE 组 CHOP 蛋白 IOD 值降低（P<0.05）；NS 组与 CIH 组比较 CHOP 蛋白 IOD 值无明显变化（P>0.05）；随时间歇低氧时间的延长，大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。结果见图 2 和表 1。
图2
各组大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达（免疫组织化学×400）
a. UC 组；b. CIH 组；c. NE 组；d. NS 组。UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达；CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞明显增多；NE 组阳性细胞的表达明显低于 CIH 组及 NS 组
表1
各组大鼠肺组织 CHOP 蛋白 IOD 值比较（n=6，
）
3 讨论
OSAHS 是最常见的睡眠呼吸疾病，由于反复发作的夜间间歇性缺氧和睡眠结构破坏，引起一系列靶器官功能受损，导致 OSAHS 患者生活质量受到严重影响。随着国内外学者对 OSAHS 不断深入研究，发现 OSAHS 对呼吸系统同样存在损伤作用，但其具体发病机制及病理改变尚不十分清楚。为进一探讨 OSAHS 对肺组织损伤的影响及可能的机制，本研究建立了模拟 OSAHS 患者夜间低氧状态的大鼠模型。结果显示，CIH 组大鼠肺组织出现明显病理形态异常变化，并且随低氧时间延长肺组织病理形态改变逐渐加重，说明 CIH 确实可导致大鼠肺组织损伤，提示 CIH 可能是 OSAHS 患者出现肺组织损伤的因素之一。
众所周知，内质网是真核细胞中非常重要的细胞器，当内质网遭受持续性外界刺激时就可以导致内质网应激反应的发生，从而进一步参与多种疾病的发生、发展，如代谢性疾病、肾脏疾病、脑认知障碍性疾病等[12-14]。参与内质网应激发生的已知外界刺激包括钙超负荷、ATP 缺乏、缺氧等。然而在诸多诱导内质网应激发生的外界因素当中，缺氧是最常见也是最重要的因素之一[15]。CHOP 为内质网应激的标志性蛋白[16-17]，也是参与细胞凋亡的重要蛋白，因此当内质网应激发生时，CHOP 蛋白的表达增强，进一步导致细胞损伤。本研究应用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白的表达，结果显示 UC 组大鼠肺组织中仅见少量 CHOP 蛋白表达，而 CIH 组大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达明显增多；且随着间歇低氧时间的延长，CHOP 蛋白的表达增多。以上结果说明 CIH 可导致大鼠肺组织 CHOP 表达增多，提示 CHOP 蛋白的表达对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定作用。
作为氧自由基有效清除剂，依达拉奉目前已广泛应用于临床[18]。其对呼吸系统疾病，如肺部缺血再灌注损伤、急性肺损伤等均有一定的肺组织保护作用[19-20]，但依达拉奉对 CIH 肺组织损伤的保护作用及其机制少有报道。本研究结果显示，UC 组大鼠肺组织未见明显病理形态改变；CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织均出现肺泡间隔增宽、水肿、结构破坏，少量炎性细胞浸润表现等异常改变；NE 组与 CIH 组及 NS 组比较，其病理形态改变程度相对较轻。进一步检测大鼠肺组织 CHOP 表达情况，UC 组仅见少量阳性细胞表达，CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织阳性细胞数量明显增多；图像分析结果发现 NE 组与 CIH 组及 NS 组比较，CHOP 蛋白的表达明显降低；且随时间歇低氧时间的延长，大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。以上实验结果说明依达拉奉对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定保护作用，且依达拉奉可能通过抑制 CHOP 蛋白的表达发挥其对肺组织的保护作用。
综上所述，CIH 大鼠肺组织中 CHOP 蛋白表达增强，CHOP 蛋白的高表达对 CIH 大鼠并发肺组织损伤起到一定作用，依达拉奉可能通过抑制 CHOP 的表达对 CIH 大鼠肺组织起到一定保护作用。但动物实验不能完全代表人体实际病理生理过程，28 d 的间歇低氧与临床多年的 OSAHS 有显著区别。因此，本研究只为 OSAHS 合并肺组织损伤发生机制及依达拉奉的干预作用提供动物实验依据，为以后的研究打下基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是呼吸科的一种常见慢性疾病，也是一种常见的睡眠障碍性疾病[1-2]。OSAHS 患者特征性夜间反复低氧复氧，使人体处于慢性间歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）状态，可引起全身多个脏器功能的严重损伤，如高血压、冠心病、心律失常、脑血管意外、糖与脂类代谢紊乱及肺动脉高压等[3-6]。但其具体发病机制尚不十分明确。因此，本研究通过建立 28 天间歇低氧大鼠模型，模拟 OSAHS 患者 CIH 状态，观察阻塞性睡眠呼吸暂停模式间歇低氧大鼠肺组织病理变化。此外，研究显示在正常情况下 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在细胞中很少表达，但在缺氧条件下其表达会上调[7-10]。因此，本研究应用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白，探讨 CHOP 蛋白在间歇低氧大鼠肺组织的表达变化，以及依达拉奉的干预作用，为 OSAHS 对人体肺组织影响的发生机制及依达拉奉的干预作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
采用随机数字表法将 120 只成年雄性 Wistar 大鼠分成正常对照组（UC 组）、慢性间歇低氧组（CIH 组）、依达拉奉干预组（NE 组）和生理盐水组（NS 组）。参照文献[11]制备间歇低氧大鼠模型。每日上午 7 时，将 UC 组放置于与 CIH 组相同的有机玻璃饲养箱内，持续注入空气 120 s，氧气（O2）体积分数维持在 210 mL/L，控制流速压力为 0.8 MPa。将 CIH 组置于有机玻璃饲养箱内，首先给予氮气（N2）30 s 使 O2 体积分数低至 50 mL/L，流速压力为 0.15 MPa，其次注入空气 40 s 恢复 O2 体积分数至 210 mL/L，流速压力控制在 0.8 MPa，然后继续注入空气 50 s 使 O2 体积分数维持在 210 mL/L，流速压力为 0.8 MPa，使低氧箱内 O2 体积分数在 50～210 mL/L 之间形成周期交替，每 120 s 为 1 个循环周期，造成间歇低氧环境；NE 组和 NS 组除暴露于同上的 CIH 组环境外，NE 组每日给予依达拉奉（3 mg/kg）尾静脉注射；NS 组每日给予等量生理盐水注射。各组大鼠生活条件及饲养条件相同。各组分别在建立模型的第 3、7、14、21、28 d 处死大鼠。本实验经本院实验动物伦理委员会批准（LX2018151）。
1.2 方法
各组大鼠均经腹腔麻醉后开胸，生理盐水快速将心、肺血管冲洗干净，取出双肺，将左侧肺浸入 4% 多聚甲醛中固定，随后进行石蜡包埋、切片，用于苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫组织化学法染色。固定包埋后肺组织切片，再经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、HE 染色，逐步染色后光镜下观察肺组织病理形态变化。
采用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 的表达，光学显微镜下观察细胞胞浆呈棕黄色或浅黄色为阳性细胞，提示 CHOP 蛋白的表达。各组大鼠随机抽取 3 张切片，按照免疫组织化学法试剂盒说明书进行操作。运用 Motic 医学图像分析系统对结果进行分析，以每张切片的积分光密度（integral optical density，IOD）值代表蛋白相对表达水平，检测 IOD 值，并做好统计。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 16.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，同一组间及同一时间点多组间比较采用单因素方差分析，经检验有统计学意义后用最小显著差异法进行两两比较。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织形态变化
UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变。CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现明显水肿、充血，肺泡间隔增宽，局部可见炎性细胞浸润；且随间歇低氧时间延长，肺组织损伤呈加重趋势。但 NE 组大鼠肺组织损伤程度明显轻于 CIH 组及 NS 组。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理学检查像（HE×400）
a. UC 组；b. CIH 组；c. NE 组；d. NS 组。UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变；CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现水肿、充血，肺泡间隔增宽，局部可见炎性细胞浸润；NE 组大鼠肺组织损伤程度轻于 CIH 组及 NS 组
2.2 大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达
免疫组织化学染色结果显示 UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达，而 CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞增多，且随时间延长，阳性细胞表达增多；NE 组阳性细胞的表达低于 CIH 组及 NS 组。图像分析结果显示，与 UC 组比较，CIH 组 CHOP 蛋白 IOD 值升高（P<0.05）；与 CIH 组比较，NE 组 CHOP 蛋白 IOD 值降低（P<0.05）；NS 组与 CIH 组比较 CHOP 蛋白 IOD 值无明显变化（P>0.05）；随时间歇低氧时间的延长，大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。结果见图 2 和表 1。
图2
各组大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达（免疫组织化学×400）
a. UC 组；b. CIH 组；c. NE 组；d. NS 组。UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达；CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞明显增多；NE 组阳性细胞的表达明显低于 CIH 组及 NS 组
表1
各组大鼠肺组织 CHOP 蛋白 IOD 值比较（n=6，）
3 讨论
OSAHS 是最常见的睡眠呼吸疾病，由于反复发作的夜间间歇性缺氧和睡眠结构破坏，引起一系列靶器官功能受损，导致 OSAHS 患者生活质量受到严重影响。随着国内外学者对 OSAHS 不断深入研究，发现 OSAHS 对呼吸系统同样存在损伤作用，但其具体发病机制及病理改变尚不十分清楚。为进一探讨 OSAHS 对肺组织损伤的影响及可能的机制，本研究建立了模拟 OSAHS 患者夜间低氧状态的大鼠模型。结果显示，CIH 组大鼠肺组织出现明显病理形态异常变化，并且随低氧时间延长肺组织病理形态改变逐渐加重，说明 CIH 确实可导致大鼠肺组织损伤，提示 CIH 可能是 OSAHS 患者出现肺组织损伤的因素之一。
众所周知，内质网是真核细胞中非常重要的细胞器，当内质网遭受持续性外界刺激时就可以导致内质网应激反应的发生，从而进一步参与多种疾病的发生、发展，如代谢性疾病、肾脏疾病、脑认知障碍性疾病等[12-14]。参与内质网应激发生的已知外界刺激包括钙超负荷、ATP 缺乏、缺氧等。然而在诸多诱导内质网应激发生的外界因素当中，缺氧是最常见也是最重要的因素之一[15]。CHOP 为内质网应激的标志性蛋白[16-17]，也是参与细胞凋亡的重要蛋白，因此当内质网应激发生时，CHOP 蛋白的表达增强，进一步导致细胞损伤。本研究应用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白的表达，结果显示 UC 组大鼠肺组织中仅见少量 CHOP 蛋白表达，而 CIH 组大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达明显增多；且随着间歇低氧时间的延长，CHOP 蛋白的表达增多。以上结果说明 CIH 可导致大鼠肺组织 CHOP 表达增多，提示 CHOP 蛋白的表达对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定作用。
作为氧自由基有效清除剂，依达拉奉目前已广泛应用于临床[18]。其对呼吸系统疾病，如肺部缺血再灌注损伤、急性肺损伤等均有一定的肺组织保护作用[19-20]，但依达拉奉对 CIH 肺组织损伤的保护作用及其机制少有报道。本研究结果显示，UC 组大鼠肺组织未见明显病理形态改变；CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织均出现肺泡间隔增宽、水肿、结构破坏，少量炎性细胞浸润表现等异常改变；NE 组与 CIH 组及 NS 组比较，其病理形态改变程度相对较轻。进一步检测大鼠肺组织 CHOP 表达情况，UC 组仅见少量阳性细胞表达，CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织阳性细胞数量明显增多；图像分析结果发现 NE 组与 CIH 组及 NS 组比较，CHOP 蛋白的表达明显降低；且随时间歇低氧时间的延长，大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。以上实验结果说明依达拉奉对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定保护作用，且依达拉奉可能通过抑制 CHOP 蛋白的表达发挥其对肺组织的保护作用。
综上所述，CIH 大鼠肺组织中 CHOP 蛋白表达增强，CHOP 蛋白的高表达对 CIH 大鼠并发肺组织损伤起到一定作用，依达拉奉可能通过抑制 CHOP 的表达对 CIH 大鼠肺组织起到一定保护作用。但动物实验不能完全代表人体实际病理生理过程，28 d 的间歇低氧与临床多年的 OSAHS 有显著区别。因此，本研究只为 OSAHS 合并肺组织损伤发生机制及依达拉奉的干预作用提供动物实验依据，为以后的研究打下基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
