引用本文: 张嘉宾, 戈艳蕾, 刘聪辉, 张盼盼, 王红阳, 朱晓颖, 李洪力, 李真真. 慢性间歇低氧大鼠肺组织中 C/EBP 同源蛋白的表达变化及依达拉奉的干预作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(4): 327-330. doi: 10.7507/1671-6205.201809023 复制
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是呼吸科的一种常见慢性疾病,也是一种常见的睡眠障碍性疾病[1-2]。OSAHS 患者特征性夜间反复低氧复氧,使人体处于慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)状态,可引起全身多个脏器功能的严重损伤,如高血压、冠心病、心律失常、脑血管意外、糖与脂类代谢紊乱及肺动脉高压等[3-6]。但其具体发病机制尚不十分明确。因此,本研究通过建立 28 天间歇低氧大鼠模型,模拟 OSAHS 患者 CIH 状态,观察阻塞性睡眠呼吸暂停模式间歇低氧大鼠肺组织病理变化。此外,研究显示在正常情况下 C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)在细胞中很少表达,但在缺氧条件下其表达会上调[7-10]。因此,本研究应用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白,探讨 CHOP 蛋白在间歇低氧大鼠肺组织的表达变化,以及依达拉奉的干预作用,为 OSAHS 对人体肺组织影响的发生机制及依达拉奉的干预作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
采用随机数字表法将 120 只成年雄性 Wistar 大鼠分成正常对照组(UC 组)、慢性间歇低氧组(CIH 组)、依达拉奉干预组(NE 组)和生理盐水组(NS 组)。参照文献[11]制备间歇低氧大鼠模型。每日上午 7 时,将 UC 组放置于与 CIH 组相同的有机玻璃饲养箱内,持续注入空气 120 s,氧气(O2)体积分数维持在 210 mL/L,控制流速压力为 0.8 MPa。将 CIH 组置于有机玻璃饲养箱内,首先给予氮气(N2)30 s 使 O2 体积分数低至 50 mL/L,流速压力为 0.15 MPa,其次注入空气 40 s 恢复 O2 体积分数至 210 mL/L,流速压力控制在 0.8 MPa,然后继续注入空气 50 s 使 O2 体积分数维持在 210 mL/L,流速压力为 0.8 MPa,使低氧箱内 O2 体积分数在 50~210 mL/L 之间形成周期交替,每 120 s 为 1 个循环周期,造成间歇低氧环境;NE 组和 NS 组除暴露于同上的 CIH 组环境外,NE 组每日给予依达拉奉(3 mg/kg)尾静脉注射;NS 组每日给予等量生理盐水注射。各组大鼠生活条件及饲养条件相同。各组分别在建立模型的第 3、7、14、21、28 d 处死大鼠。本实验经本院实验动物伦理委员会批准(LX2018151)。
1.2 方法
各组大鼠均经腹腔麻醉后开胸,生理盐水快速将心、肺血管冲洗干净,取出双肺,将左侧肺浸入 4% 多聚甲醛中固定,随后进行石蜡包埋、切片,用于苏木精–伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及免疫组织化学法染色。固定包埋后肺组织切片,再经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、HE 染色,逐步染色后光镜下观察肺组织病理形态变化。
采用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 的表达,光学显微镜下观察细胞胞浆呈棕黄色或浅黄色为阳性细胞,提示 CHOP 蛋白的表达。各组大鼠随机抽取 3 张切片,按照免疫组织化学法试剂盒说明书进行操作。运用 Motic 医学图像分析系统对结果进行分析,以每张切片的积分光密度(integral optical density,IOD)值代表蛋白相对表达水平,检测 IOD 值,并做好统计。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 16.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,同一组间及同一时间点多组间比较采用单因素方差分析,经检验有统计学意义后用最小显著差异法进行两两比较。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织形态变化
UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变。CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现明显水肿、充血,肺泡间隔增宽,局部可见炎性细胞浸润;且随间歇低氧时间延长,肺组织损伤呈加重趋势。但 NE 组大鼠肺组织损伤程度明显轻于 CIH 组及 NS 组。结果见图 1。

a. UC 组;b. CIH 组;c. NE 组;d. NS 组。UC 组大鼠肺组织未见明显病理改变;CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺组织上皮细胞出现水肿、充血,肺泡间隔增宽,局部可见炎性细胞浸润;NE 组大鼠肺组织损伤程度轻于 CIH 组及 NS 组
2.2 大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达
免疫组织化学染色结果显示 UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达,而 CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞增多,且随时间延长,阳性细胞表达增多;NE 组阳性细胞的表达低于 CIH 组及 NS 组。图像分析结果显示,与 UC 组比较,CIH 组 CHOP 蛋白 IOD 值升高(P<0.05);与 CIH 组比较,NE 组 CHOP 蛋白 IOD 值降低(P<0.05);NS 组与 CIH 组比较 CHOP 蛋白 IOD 值无明显变化(P>0.05);随时间歇低氧时间的延长,大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。结果见图 2 和表 1。

a. UC 组;b. CIH 组;c. NE 组;d. NS 组。UC 组肺泡上皮细胞仅见少数阳性细胞表达;CIH 组、NE 组、NS 组大鼠肺泡上皮细胞阳性细胞明显增多;NE 组阳性细胞的表达明显低于 CIH 组及 NS 组


3 讨论
OSAHS 是最常见的睡眠呼吸疾病,由于反复发作的夜间间歇性缺氧和睡眠结构破坏,引起一系列靶器官功能受损,导致 OSAHS 患者生活质量受到严重影响。随着国内外学者对 OSAHS 不断深入研究,发现 OSAHS 对呼吸系统同样存在损伤作用,但其具体发病机制及病理改变尚不十分清楚。为进一探讨 OSAHS 对肺组织损伤的影响及可能的机制,本研究建立了模拟 OSAHS 患者夜间低氧状态的大鼠模型。结果显示,CIH 组大鼠肺组织出现明显病理形态异常变化,并且随低氧时间延长肺组织病理形态改变逐渐加重,说明 CIH 确实可导致大鼠肺组织损伤,提示 CIH 可能是 OSAHS 患者出现肺组织损伤的因素之一。
众所周知,内质网是真核细胞中非常重要的细胞器,当内质网遭受持续性外界刺激时就可以导致内质网应激反应的发生,从而进一步参与多种疾病的发生、发展,如代谢性疾病、肾脏疾病、脑认知障碍性疾病等[12-14]。参与内质网应激发生的已知外界刺激包括钙超负荷、ATP 缺乏、缺氧等。然而在诸多诱导内质网应激发生的外界因素当中,缺氧是最常见也是最重要的因素之一[15]。CHOP 为内质网应激的标志性蛋白[16-17],也是参与细胞凋亡的重要蛋白,因此当内质网应激发生时,CHOP 蛋白的表达增强,进一步导致细胞损伤。本研究应用免疫组织化学法检测大鼠肺组织中 CHOP 蛋白的表达,结果显示 UC 组大鼠肺组织中仅见少量 CHOP 蛋白表达,而 CIH 组大鼠肺组织 CHOP 蛋白表达明显增多;且随着间歇低氧时间的延长,CHOP 蛋白的表达增多。以上结果说明 CIH 可导致大鼠肺组织 CHOP 表达增多,提示 CHOP 蛋白的表达对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定作用。
作为氧自由基有效清除剂,依达拉奉目前已广泛应用于临床[18]。其对呼吸系统疾病,如肺部缺血再灌注损伤、急性肺损伤等均有一定的肺组织保护作用[19-20],但依达拉奉对 CIH 肺组织损伤的保护作用及其机制少有报道。本研究结果显示,UC 组大鼠肺组织未见明显病理形态改变;CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织均出现肺泡间隔增宽、水肿、结构破坏,少量炎性细胞浸润表现等异常改变;NE 组与 CIH 组及 NS 组比较,其病理形态改变程度相对较轻。进一步检测大鼠肺组织 CHOP 表达情况,UC 组仅见少量阳性细胞表达,CIH 组、NE 组及 NS 组大鼠肺组织阳性细胞数量明显增多;图像分析结果发现 NE 组与 CIH 组及 NS 组比较,CHOP 蛋白的表达明显降低;且随时间歇低氧时间的延长,大鼠肺组织中 CHOP 的表达逐渐增多。以上实验结果说明依达拉奉对 CIH 大鼠肺组织损伤起到一定保护作用,且依达拉奉可能通过抑制 CHOP 蛋白的表达发挥其对肺组织的保护作用。
综上所述,CIH 大鼠肺组织中 CHOP 蛋白表达增强,CHOP 蛋白的高表达对 CIH 大鼠并发肺组织损伤起到一定作用,依达拉奉可能通过抑制 CHOP 的表达对 CIH 大鼠肺组织起到一定保护作用。但动物实验不能完全代表人体实际病理生理过程,28 d 的间歇低氧与临床多年的 OSAHS 有显著区别。因此,本研究只为 OSAHS 合并肺组织损伤发生机制及依达拉奉的干预作用提供动物实验依据,为以后的研究打下基础。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。