引用本文： 李乃健, 潘天惠, 何芳, 冉丕鑫. 流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞吞噬荧光标记细菌的方法学探讨. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(5): 479-483. doi: 10.7507/1671-6205.201803034 复制
目前国内外学者广泛选用肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）作为实验对象来研究相关呼吸系统疾病的发病机制。AM 存在于呼吸道（绝大部分在肺泡腔），通过分泌系列的细胞因子、炎症介质和吞噬外源性微颗粒如细菌、病毒和空气污染物而参与气道免疫应答和防御[1]，而且通过吞噬清除潜在的病原性微生物的作用在保持肺里无菌环境中起关键作用。近期研究发现慢性阻塞性肺疾病患者 AM 吞噬细菌的能力下降，有可能是导致患者反复发生下呼吸道细菌性感染的重要原因之一[2-3]，而在哮喘患者中同样发现 AM 吞噬凋亡细胞减少[4]。因此，研究 AM 的吞噬功能对于了解相关疾病的发病机制具有重要意义。
1982 年 Steinkamp 等[5]首创荧光微球流式细胞术定量检测吞噬功能，发展至今，结合各种荧光标记技术，流式细胞术在单核–巨噬细胞吞噬功能研究中的应用越来越广。流式细胞术用于检测巨噬细胞吞噬功能可轻易地观察数千到数万个细胞，而且具有分析速度快、重复性好和特异性强等优点[6]。AlexaFluor 488（AF488）是由美国生命技术公司（Life technologies）旗下的分子探针公司（Molecular Probes）新开发的绿色荧光染料，目前国内少有其标记细菌用于检测吞噬功能的相关报道。因此，本研究的主要目的是初步建立流式细胞术检测大鼠 AM 吞噬 AF488 标记细菌的方法学。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细菌
无特定病原级 SD 雄性大鼠，180～220 g，8 周龄，购自广州中医药大学实验动物中心［动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0034］。金黄色葡萄球菌（编号 1.2386）及肺炎链球菌（编号 1.8722）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。
1.2 主要仪器和试剂
流式细胞仪 BD Accuri® C6（美国 Becton Dickinson），LSM880 激光共聚焦荧光显微镜（德国 Carl Zeiss），高速离心机（美国 eppendorf）。磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、无血清 1640 培养基、AF488、CellTracker Red CMPTX dye 购自 Invitrogen 公司，胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自 Gibco 公司，NaHCO3、二甲基亚砜、0.4% 台盼蓝溶液购自 Sigma 公司，Lab-Tek 培养腔室载玻片购自 Merck Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 AM 的获取
本实验符合实验动物伦理学要求。取无特定病原级 SD 雄性大鼠，1% 戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔麻醉，暴露肺部及气管后行气管插管术，36 mL 预冷 PBS 分 4 次注入肺部，分批收集支气管肺泡灌洗液；1 200 r/min 离心 5 min，弃上清，每管加入 2 mL 1× RBC 裂解液，混匀溶血 5 min，加 5 mL 无血清 1640 培养基中和混匀，1 200 r/min 离心 5 min，重复洗涤 2 次，细胞重悬于含 10% FBS 的 1640 培养基中，在 37 ℃ 含 5% CO2 的细胞培养箱中贴壁 2 h；预冷 PBS 洗涤 2 次后贴壁细胞经 Diff-Quik 染色证实 98% 为 AM[7]，随后收获细胞并调整为 2.0×105/孔。
1.3.2 细菌的培养与计数
金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌菌株在哥伦比亚血平板上获取单个菌落并接种于 LB 液体培养基中增菌（200 r/min，37 ℃，5% CO2），当细菌生长至对数期且吸光度值>0.5 时收获细菌，4 000 r/min 离心 10 min，重悬于 5 mL PBS；取其中 1 μL 行连续稀释至 1×10–6 并接种于血平板上，于次日计算菌落形成单位得出细菌总数；在 60 ℃ 水浴条件下 2 h 将细菌灭活，PBS 洗涤 2 次后重悬于 5 mL PBS 并分装为 1 mL/管，–20℃ 保存。菌落总数计算公式：每 μL 菌液中的细菌总数=（N/V）×d。其中，N 为某稀释倍数下适宜范围内的平均菌落数；V 为涂布平板时所用的稀释液的体积，单位为 μL；d 为稀释倍数。
1.3.3 细菌的荧光标记与检测
细菌解冻后离心（8 000 r/min，10 min），吸弃上清液并重悬于 1 mL 0.1 mol/L 的 NaHCO3，将每管细菌数浓度调整为 1.0×106/μL。参考 Taylor 等[3]标记细菌的方法，用二甲基亚砜配制 AF488 母液浓度为 2 mg/mL，加入到细菌悬液中，使 AF488 终浓度分别为 10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL。然后室温、避光、摇床孵育 6 h，取出后离心弃上清，预冷 PBS 清洗 3 次，重新悬浮于无血清 1640 培养基，避光保存于 –20 ℃ 备用。参照文献[8]中的检测细菌标记率的方法，用流式细胞仪检测 AF488 标记金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的阳性比例，以确定金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率。
1.3.4 AM 吞噬率与吞噬指数的检测
参照文献[9]的方法。在 24 孔板中调整 AM 浓度为 2.0×105/孔，分别以 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100 和 1∶200 的细胞与细菌比例，在含细胞培养箱中（37 ℃，5% CO2）孵育 2、4、6 和 8 h，获取时效曲线，以选取合适的吞噬时间点。随后加入 0.4% 台盼蓝溶液 10 μL 作用 1 min 淬灭细胞外荧光并终止反应，预冷 PBS 洗涤 3 次，胰酶消化 5 min 收获细胞后制备成单细胞悬液。AM 经流式细胞仪获取数据，测荧光时先在前向散射光和边角散射光二维散点图中，根据细菌及 AM 大小及颗粒密度设定巨噬细胞区域，在检测绿色荧光的 FL1-A 直方图中用空白管（未加荧光菌孵育的巨噬细胞）设定线性门的阳性区域，以阳性率代表吞噬率，阳性巨噬细胞的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）与细菌的 MFI 比值代表吞噬指数。
1.3.5 激光共聚焦荧光显微镜检测
将 AM 直接接种于 8 孔的 Lab-Tek 培养腔室载玻片（2×105/300 μL/孔），按 1∶100 比例加入已标记的金黄色葡萄球菌，在 37 ℃、5% CO2 条件下孵育 4 h，终止吞噬反应。加入终浓度为 12.5 μmol/L 的 CellTracker Red CMPTX dye 培养 30 min 后吸弃培养液继续以 1640 培养基培养 30 min，4% 预冷的多聚甲醛固定细胞 10 min，将细胞孵育于 200 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（250 μmol/L）3 min，PBS 洗涤 4 次，去掉腔室，盖玻片固定，在激光共聚焦荧光显微镜下检测。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 21.0 统计软件。数值以均数±标准差（
±s）表示。采用方差分析两两比较 LSD 及两样本均数的 t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度 AF488 对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌标记率的影响
AF488 对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌标记率和 MFI 的影响在一定范围内呈浓度依赖性。与低浓度（10 μg/mL）相比，当 AF488 的浓度大于 50 μg/mL 时，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率均大于 92%。虽然金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的 MFI 随着 AF488 浓度的增加而增强，但标记率在荧光染料浓度大于 50 μg/mL 便已迅速达到上限（表 1、图 1）。故本实验后续评价不同细菌比例和孵育时间对 AM 吞噬率和吞噬指数的影响，使用 AF488 标记肺炎链球菌的浓度为 100 μg/mL。
表1
不同浓度 AF488 对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率和 MFI 的比较（n=3，
）
图1
不同浓度 AF488 标记下金黄色葡萄球菌（a）和肺炎链球菌（b）的 MFI
随着 AF488 的浓度增高，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的 MFI 升高
2.2 不同细菌比例对 AM 吞噬率和吞噬指数的影响
AM 对肺炎链球菌的吞噬率以及吞噬指数随着细菌比例的增加而升高。将 AM 与肺炎链球菌按照 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200 和 1∶300 的比例孵育 4 h，发现 AM 的吞噬率随着细菌与细胞比例的增加而显著升高（P<0.01）。结果见表 2。
表2
不同细菌比例对 AM 吞噬率和吞噬指数的影响（n=6，
）
2.3 不同孵育时间对 AM 吞噬率和吞噬指数的影响
将 AM 与肺炎链球菌按照 1∶100 孵育 2、4、6 和 8 h，AM 的吞噬率从孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%（P<0.05）。同时 AM 的吞噬指数随着孵育时间的延长而升高，从孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但延长孵育时间而导致吞噬指数的升高并没有增加细菌比例而导致的吞噬指数升高来得明显。由此可得出增加细菌比例对吞噬指数的影响更为关键。结果见表 3。
表3
不同孵育时间对 AM 吞噬率和吞噬指数的影响（n=6，
）
2.4 激光共聚焦荧光显微镜结果
AM 与肺炎链球菌按照 1∶100 孵育 4 h 后，进行激光共聚焦荧光显微镜观察，由图 2 可见，在细胞与细胞之间的背景并没有观察到有绿色荧光，证明并没有多余的带荧光肺炎链球菌影响检测结果。通过对细胞核蓝色荧光、胞浆红色荧光的对比染色，结合细菌的绿色荧光，可在激光共聚焦荧光显微镜下清晰地分辨绝大部分肺炎链球菌被吞噬进细胞胞浆内，在细胞轮廓内呈绿色荧光的为吞噬进入胞内的肺炎链球菌。
图2
激光共聚焦荧光显微镜下肺炎链球菌在 AM 中的分布
a. 呈绿色荧光的肺炎链球菌；b. 按比例共同孵育的 AM 与肺炎链球菌的融合图像。通过对 DAPI 染的细胞核蓝色荧光和 CellTracker Red CMPTX dye 所染的胞浆红色荧光对比可知，绝大部分肺炎链球菌被吞噬进入胞浆
3 讨论
AM 在抵抗颗粒物及病原微生物的入侵中具有极为重要的地位，AM 吞噬活性的降低可能会导致进入肺部的病原体不能被清除而在肺部快速增殖，AM 吞噬功能降低亦可降低其抗原提呈能力，使肺部感染的发生率增加。传统检测 AM 吞噬功能主要采用碳廓清实验和吞噬鸡红细胞实验，但这两项传统检测方法效率低、准确性差，有一定的局限性[10]。1982 年 Steinkamp 等[5]首创荧光微球流式细胞术定量检测吞噬功能，现今结合各种荧光标记技术，使得流式细胞术在单核–巨噬细胞吞噬功能的研究中应用更为广泛。
AF488 是新开发的绿色荧光染料，AF488 偶联蛋白优于其他荧光素，实验证明其比包括异硫氰酸荧光素和 Cy2 的其他绿色荧光基团都好，不仅亮度高，而且光稳定性更好，在 pH4～10 的范围内均能保持稳定[11-12]。本实验发现，AF488 对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌标记率和 MFI 的影响在一定范围内呈浓度依赖性，这表明当使用 AF488 标记细菌时，AF488 需要达到一定的工作浓度，最少需要达到 50 μg/mL，这与异硫氰酸荧光素标记结核分枝杆菌的浓度相近[8]。随着 AF488 浓度的升高，虽然 MFI 明显升高，但是标记率并没有明显提高，因此从经济效益出发应该在 50～100 μg/mL 中选择合适的标记浓度。
实验发现，肺炎链球菌与 AM 的比例对吞噬率有一定程度的影响，肺炎链球菌浓度越高，吞噬率越高，但 AM 的吞噬能力很强，不易达到饱和，故在检测 AM 吞噬功能时选用合适的细菌与细胞比例（如 1∶100）就已能够反映真实的吞噬能力[9]。与此同时，AM 的吞噬率和吞噬指数随着孵育时间的延长而升高，吞噬率从孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%，吞噬指数从孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但这与之前报道的腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的结果有所不同[13]。推测可能原因，一方面是 AM 的吞噬能力很强，不易达到饱和，在整个孵育过程中 AM 对细菌不断进行吞噬作用；另一方面，由于胞吐作用，吞噬了荧光微球的腹腔巨噬细胞排出了部分荧光微球，而 AM 却对吞噬进入胞浆的细菌进行消化，消化后的 AF488 残留在胞浆内使得胞浆染色，从而使得 MFI 升高。但这些推测还需要进一步验证。
综上所述，流式细胞术检测 AM 吞噬 AF488 标记细菌是一种简便、快速和重复性好的方法。建立该实验准确的方法学对于研究 AM 对细菌的吞噬功能具有重要的意义。但在应用过程中需要注意两点。（1）在去除细胞外多余细菌时，采取台盼蓝淬灭细胞外荧光标记的方法来达到去除多余细菌荧光的目的，并用预冷的 PBS 进行冲洗。（2）细胞刮收集细胞易引起细胞物理形态改变，且细胞碎片较多，影响分析结果，故本实验使用胰酶消化法，但胰酶消化法操作繁琐，不适宜大量样本检测。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
